复合保鲜剂对冷冻牛蛙保鲜效果的影响

任中阳，黄香兰，崔雅清，焦 敏，石林凡，2，杨 燊，2，郝更新，2，邱绪建，2，陈玉峰，赵永强，翁武银，2

（1. 集美大学海洋食品与生物工程学院，福建厦门 361021；2. 厦门市海洋功能食品重点实验室，福建厦门 361021；3. 浙江省深蓝渔业资源高效开发利用重点实验室，浙江杭州 310014；4. 中国水产科学研究院南海水产研究所，农业农村部水产品加工重点实验室，广东广州 510300）

0 引言

牛蛙属于两栖纲、无尾目蛙科，是一种大型食用蛙。牛蛙生长速度快，味鲜肉嫩、营养丰富，具有一定的药用价值，由于其具有高蛋白、低脂肪的特点而深受消费者喜爱。除了牛蛙肉外，牛蛙皮、牛蛙油也能被充分利用，可产生较高的经济效益，因而牛蛙也逐渐成为我国重要水产品之一。牛蛙表面的活性肽在抑菌方面具有一定作用[1]。牛蛙富含蛋白质，死后会出现僵直、解僵、自溶和腐败的现象，肌肉中的ATP 会分解释放能量，使蛙体体温上升，其新鲜度也会受到影响，还会造成营养物质损失、品质下降、货架期缩短等问题[2]。牛蛙保藏不当，难以保证其品质，因此研究牛蛙保鲜技术具有重要意义。

目前，有关水产品保鲜的方法有物理方法、化学方法和生物方法，化学方法是通过加入食品保鲜剂以延长食品保质期，常用化学保鲜剂有磷酸盐、柠檬酸、苯甲酸等，虽然单一保鲜剂的种类比较繁多，但单一保鲜技术与保鲜剂在食品保鲜中不具有优势，只针对某一特定的腐败菌发挥作用，促使复合保鲜技术的研究开发[3]。水产品在冻藏过程中，若形成大且不均匀的冰晶会对水产品品质造成不良影响[4]。选择合适的冻藏方式或保鲜剂可减少对品质的损害。水产品在冻藏过程中蛋白质会发生变性和品质下降，酶活性下降，黏度变低，蛋白质分子凝集，空间立体结构发生变化[5]。蛋白质变性后，冻结水产品的组织质地变干变硬，加工适宜性下降，产品缺乏弹性。而采用保鲜剂可有效改善冻藏品在冻结过程中发生的品质问题。

目前，常用的保鲜剂主要有4 类，分别是复合磷酸盐、糖类、蛋白水解产物、抗冻蛋白[6]。有关牛蛙保鲜剂的研究与技术开发还不完善[7]。当前，有关牛蛙的研究主要包括其基本营养成分分析、营养学、组织学、药用价值和生理学和养殖等方面[8]。牛蛙作为一种低脂肪、高营养的食品，应用范围广且具有一定的发展前景，目前有很多有关于水产保鲜的研究，但对牛蛙保鲜有待深入探究。因此通过研究复合磷酸盐类保鲜剂，分析焦磷酸钠、三聚磷酸钠及六偏磷酸这3 类保鲜抗冻剂复合对于牛蛙冷冻效果的影响，以此为牛蛙保鲜提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鲜活牛蛙，购自厦门市集美区石鼓路水产市场；氯化钠、氯化钾、氢氧化钠、氯化钙、氯化镁，西陇科学股份有限公司提供；无水乙醚、氢氧化钠、ATP、三羧酸（Tricarboxylic acid，TCA）、硝酸、硫酸亚铁、三聚磷酸钠、六偏磷酸钠、焦磷酸钠、海藻糖、乙酸镁，国药集团化学试剂有限公司提供；Tris- 马来酸、乙二醇双（2- 氨基乙基醚） 四乙酸（Ethylene glycol tetraacetic acid，EGTA） 溶液、钼酸铵、山梨糖醇、甘油，上海麦克林生化科技有限公司提供；Lowry 试剂盒，深圳子科生物科技有限公司提供。所有试剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

UV-1750 型紫外荧光分光光度计，日本岛津公司产品；Avanti J-26xp 型冷冻离心机，贝克曼库尔特有限公司产品；G:Box 型凝胶电泳成像仪，英国Syngene 公司产品；SX2-10-13 型马弗炉，上海石研电炉有限公司产品；Avanti J-26xp 型高速分散均质机，上海标本模型厂产品；Q-2000 型差式扫描量热仪，美国TA 公司产品；FJ-200 型恒温水浴锅，国华电器有限公司产品。

1.3 试验方法

1.3.1 样品制备

将牛蛙宰杀清洗干净后，取牛蛙大腿部位和整只牛蛙，采用一定浓度复合保鲜剂，优化最佳磷酸盐配比，通过复合磷酸盐浸泡处理1 h，放入冰箱冻藏3 个月，用于DSC 测定。

1.3.2 单因素试验

固定处理条件：1%海藻糖，0.5%山梨糖，1%氯化钠和1%甘油，分别探究3 种保鲜剂即焦磷酸钠、三聚磷酸钠和六偏磷酸钠在不同质量分数下对牛蛙的保鲜效果。3 种保鲜剂质量分数梯度设为0.1%，0.5%，1%，3%，5%。

1.3.3 保鲜剂复合正交试验

在单因素试验基础上，以冰点和相变焓为指标，按正交表进行复配。每组重复2 次，浸泡1 h 后采用DSC 法测定冰点和相变焓的变化确定保鲜剂最佳配比。

正交试验因素与水平设计见表1。

表1 正交试验因素与水平设计/%

1.3.4 冰点测定

参考李红梅等人[9]方法测定，略有改动。称取4～8 mg 牛蛙肉进行测定，空白坩埚为参比，以5 ℃/min降温至-30 ℃，用1 ℃/min 升温到3 ℃。利用DSC数据处理软件进行分析，获取牛蛙的冰点和相变焓等热力学参数。

1.3.5 水分含量测定

参考宋健[10]的方法，略有改动。事先准备好干燥皿，取相同质量牛蛙肉置于3 个干燥皿中，置于105 ℃烘箱内，烘制1.5 h 后取出，将盖子盖好后于干燥器中回温，再烘制30 min，降温后进行称重，至前后2 次相差不大于0.000 5 g。

1.3.6 蛋白质含量测定

参考黎勇等人[11]的方法略有改动。配制2 mol/L氢氧化钠溶液50 mL，加入牛蛙肉后搅拌1 h，以转速10 000 r/min 离心10 min。取上清稀释5 倍，利用Lowry 法于波长750 nm 处测定吸光度，用于蛋白质的定量。用蒸馏水进行调零，以水作为对照，由标准曲线计算出牛蛙中蛋白质含量。

1.3.7 粗脂肪含量测定

参考Cunha A F 等人[12]的方法，略有改动。取约4 g 经处理的牛蛙肉包好放入抽提筒中，加入无水乙醚至瓶容量2/3 处，在40 ℃水浴抽提6～12 h，直至脂肪完全浸出为止。将收集瓶中乙醚水浴蒸发至1～2 mL时，于100 ℃下烘干2 h，放入干燥仪器冷却后称量，重复以上步骤至恒质量。

1.3.8 牛蛙总灰分测定

参考Akinyele I O 等人[13]利用马弗炉灰化法，略有所改动。将坩埚先烘干，称约0.1 g 样品放入坩埚烧1 h，冷却后放入马弗炉。于550 ℃下灼烧3 h，取出冷却1 h，重复上述步骤2 次，取出后冷却称重。

1.3.9 SDS- PAGE 凝胶电泳

参照夏轩泽等人[14]做法有所改动。先是进行牛蛙试验原液的配制，600 μL 蛋白质样品和400 μL 上样缓冲液作为电泳样品，使样品质量浓度为1 mg/mL，混合反应0.5 h。采用6%浓缩胶与8%分离胶，初始电压为8 V，当进入分离胶后，将电压提高到12 V，电泳1 h。用考马斯亮蓝R-250 染色10 min，用体积比1∶1 醋酸乙醇混合脱色液脱色，用凝胶电泳成像仪拍照分析。

1.3.10 ATP 酶活性测定

参照许萍等人[15]做法并有所改动。用0.6 mol/L KCl（pH 值7） 提取牛蛙蛋白，取4 个平行样品分别加入10 mmol/LCa2+溶液、2 mmol/LMg2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.1 mmol/L Ca2+溶液、2 mmol/L Mg2+溶液和0.5 mmol/L EGTA 溶液各7.9 mL，各添加20 mmol/L ATP 标准溶液0.5 mL，反应8 min 后，添加15%TCA 溶液5 mL，反应结束后在常温下放置15 min，取3 mL 反应液，以转速7 060 r/min 离心5 min。取1 mL 离心后的上清液，加入硫酸亚铁钼酸铵溶液2 mL，显色1 min 后，于波长660 nm 处测吸光度。

1.3.11 牛蛙盐溶蛋白含量测定

参考Han Z Y 等人[16]的方法有所改动。取1 g 牛蛙大腿组织至浓度为0.6 mol/L 的KCl 溶液50 mL中，在冰水浴中使用均质仪器以8 000 r/min 转速处理，搅拌浸提1 h，混合物以转速10 000 r/min 离心10 min，用Lowry 法测蛋白含量。

1.4 数据处理

所有数据使用Origin 2019 软件作图，用SPSS 和Excel 软件进行方差和显著性分析，显著性水平为p＜0.05。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

磷酸盐质量分数对牛蛙冰点的影响见图1。

图1 磷酸盐质量分数对牛蛙冰点的影响

焦磷酸钠、三聚酸钠、六偏磷酸钠不同质量分数对牛蛙冰点的影响结果。由图1 可知，3 种保鲜剂在合适的质量分数范围内均可在一定程度上降低牛蛙冰点。新鲜牛蛙的冰点和相变焓分别为-0.8 ℃和231.7 J/g。牛蛙肉的冰点和相变焓均随磷酸盐溶液质量分数的升高而下降。在同质量分数情况下，焦酸钠复合抗冻剂浸泡的鱼肉冰点和相变焓下降最明显。当复合抗冻剂中焦磷酸钠质量分数大于3%时，牛蛙的冰点和相变焓不再发生明显的变化。其原因可能是牛蛙在冻藏中，肌肉细胞与组织细胞中冰晶会不断形成变大，使肌肉蛋白变形，随着焦磷酸钠质量分数的增加，冰点降低，冰晶逐渐变小，从而减少牛蛙蛋白质结构的破坏[17]。而当三聚磷酸钠质量分数大于1%时，牛蛙肉冰点与相变焓变化较小，可能是由于牛蛙在冻藏时，肌肉中的结合水脱离，导致分子内形成二硫键，使蛋白质凝聚发生变性[18]。六偏磷酸钠质量分数大于1%时，牛蛙肉冰点与相变焓变化差异不显著，由此可见，在焦磷酸钠、三聚酸钠、六偏磷酸钠3 种保鲜剂质量分数1%～3%，有利于冰点降低，综合考虑3 种保鲜剂均选取1%～3%用于后续的优化试验。

2.2 复合保鲜对牛蛙冰点的影响

保鲜剂复合正交试验结果见表2。

由表2 可知，根据极差R分析，各因素对牛蛙冰点的变化影响顺序为A＞B＞C，即焦磷酸钠＞三聚磷酸钠＞六偏磷酸钠。最优条件为A3B2C2，即3%焦磷酸钠，2%三聚磷酸钠和2%六偏磷酸钠。将此复合保鲜剂应用于牛蛙的贮藏保鲜上，能有效抑制大冰晶的形成。抑制冰晶的生长，有利于食品在低温条件下的贮藏[19]。若不加控制，随贮存时间延长，冰晶增大不利于肉制品的保藏[20]。

表2 保鲜剂复合正交试验结果

2.3 牛蛙成分分析

试验测得牛蛙水分含量达80.57%，粗脂肪含量仅为0.40%，蛋白含量为4.60%。

牛蛙基本成分见表3。

表3 牛蛙基本成分

试验所用的牛蛙蛋白质含量明显高于其鱼肉、牛肉、鸡肉和猪肉[21-23]。牛蛙属于高蛋白低脂肪且营养价值较高的优质肉类[24]。灰分是样品经高温灼烧后残留下来的无机物，属于营养的参考指标之一，研究测定的牛蛙肉灰分含量明显高于其他动物肉[25]。

2.4 牛蛙蛋白质的凝胶电泳结果分析

牛蛙蛋白质电泳结果图见图2。

图2 牛蛙蛋白质电泳结果图

由图2 可知，蛋白质分子量在32～44 kDa 的条带清晰。72 kDa 左右的蛋白，包括分子量在98～100，135，170 kDa 等处的条带也能看到。最明显看到的是分子量在200 kDa 左右的蛋白质条带颜色深且清晰。分子量40 kDa 处为辅肌动蛋白，分子量在32 kDa 左右为前Ⅰ型胶原α1链，分子量35 kDa 是角蛋白13，分子量72 kDa 为信号识别例子亚基和分子量135 kDa 的胶原蛋白α1链，与樊雨梅等人[26]的分析结果相一致。100 kDa 是副肌球蛋白，200 kDa处为肌球蛋白重链，200 kDa 以上条带密集且颜色最深，可能是碱溶性蛋白和胶原蛋白的特征条带，这与杨慧等人[27]研究大鲵肌肉分离蛋白特性结果相似。综上所述，试验所用的牛蛙，其蛋白主要是肌球蛋白和肌动蛋白。

2.5 酶活性对比

复合保鲜剂处理对牛蛙ATP 酶活性的影响见图3。

图3 复合保鲜剂处理对牛蛙ATP 酶活性的影响

冻藏过程中所形成的冰晶和升高的离子浓度会使蛋白质发生改变，导致肌球蛋白球状头部的Ca2+-ATPase 酶活下降，因此在冻藏过程中Ca2+-ATPase 酶活的变化情况可以作为肉冷冻保护效果的指标[28]。由图3 可知，新鲜牛蛙Ca2+-ATP、Mg2+-ATP、Ca2+-Mg2+-ATP、Mg2+-EGTA 酶活性分别为0.31，0.35，0.45，0.35 μmol/mg·min，未经保鲜剂浸泡处理冻藏3 个月后酶活性分别为0.09，0.16，0.10，0.08 μmol/mg·min，经保鲜剂处理后酶活性分别是0.22，0.25，0.29，0.13 μmol/mg·min。由此可见，经复合保鲜剂处理后的牛蛙酶活性都有明显升高趋势，其中未经处理的Ca2+-Mg2+-ATP 酶活力和使用复合保鲜剂处理的试验组未经处理而冻藏3 个月的对照组酶活性显著性降低，这也间接说明，复合保鲜剂的浸泡前处理在减缓牛蛙品质下降中起到了显著的效果[29]。参考李志鹏等人[30]的试验发现导致Ca2+-ATP酶活性下降的原因是因为在冻藏过程中，肌球蛋白球状头部构象发生改变或者相互聚集，与所研究结果一致。结果表明，在试验条件下的复合保鲜剂即2%六偏磷酸钠，2%三聚磷酸钠和3%焦磷酸钠，同未经处理的牛蛙相比，可使牛蛙的酶活提高至1.5 倍以上。这表明复合保鲜剂对冷冻牛蛙的ATP 酶活性有明显的保护作用。2.6 盐溶性含量对比牛蛙肉中肌肉蛋白的功能性质主要由盐溶性蛋白肌原纤维蛋白体现，测定盐溶性蛋白的含量可以反映冻藏过程中牛蛙功能特性的变化。

牛蛙盐溶蛋白质量浓度对比见图4。

由图4 可知，新鲜牛蛙盐溶蛋白质量浓度2.83 mg/mL，未经复合保鲜剂处理是1.86 mg/mL，经保鲜剂处理是2.33 mg/mL。试验表明，2%六偏磷酸钠、3%焦磷酸钠、2%三聚磷酸钠的保鲜剂复合的处理，有效抑制了盐溶性蛋白质量浓度的下降。复合磷酸盐中的磷酸根离子可以增强鱼肉离子强度，提高pH 值，增强肌动球蛋白的亲水性，延缓蛋白质的冷冻变性[31]。

3 结论

试验通过对牛蛙进行基本成分的测定，对比新鲜牛蛙加保鲜剂冷冻前后ATP 酶活性和盐溶蛋白含量，探究了复合保鲜剂对于牛蛙冷冻效果的影响。试验结果表明，牛蛙的水分含量为80.57%，粗脂肪含量为0.41%，粗灰分含量为1.10%，蛋白含量为4.6 mg/mL。通过电泳分析蛋白质分子量表明大多集中在40 kDa 和200 kDa 左右。3 种保鲜剂对牛蛙冰点影响的优化结果为3%焦磷酸钠，2%三聚磷酸钠和2%六偏磷酸钠的复合保鲜剂。经牛蛙肌肉ATP 酶活性和盐溶蛋白含量的对比，表明经此复合保鲜剂浸泡1 h 后冷冻牛蛙ATP 酶活性比未处理组牛蛙的酶活性提高至1.5 倍以上。新鲜牛蛙的盐溶蛋白含量是2.83 mg/mL。未经复合保鲜剂处理而冷冻后的是1.86 mg/mL，但经复合保鲜剂处理冷冻后为2.33 mg/mL。试验表明，3 种保鲜剂复合能有效降低冷冻对牛蛙的伤害，提高其新鲜度，为牛蛙保鲜提供了理论基础。