土壤因子对雅连6种生物碱积累的影响

吴虎平,孙 海,阮音音,梁 浩,严光玉,张亚玉,3

(1.中国农业科学院特产研究所,长春 130112;2.吉林省中药材种植(养殖)重点实验室,长春 130112;3.成都大学药学与生物工程学院,成都 610106;4.瓦屋山药业有限责任公司,四川 眉山 620365)

【研究意义】雅连为毛莨科植物三角叶黄连(CoptisdeltoideaC.Y.Cheng et Hsiao),属多年草本植物,以根入药,为药材黄连基源之一,是四川著名道地药材[1]。雅连的药用历史悠久,具有清热燥湿、湾火解毒的功效[2-3],其药用部位为主根,主要药效成分是生物碱,含量较高的是小檗碱、黄连碱、药根碱和巴马汀,而表小檗碱和非洲防己碱含量较低。2020年版《中国药典》规定了雅连的质量,以盐酸小檗碱(C20H18CINO4)计,小檗碱(C20H18CINO4)含量不少于4.5%[2]。雅连对种植条件要求苛刻,目前仅分布在以眉山市为中心的峨眉山市、眉山市洪雅县与雅安市的交界地带[4],现已处于濒危状态,如何保护野生雅连资源,科学发展雅连种植业,已是当务之急。【前人研究进展】不同的土壤特征和环境组成的巨大空间异质性对雅连药材性状、结构组成、有效成份、功效等均存在不同程度的影响[5-7],其中,有研究证实不同生境条件下雅连有效成份差异较大,且化学成分与土壤因子存在显著相关性[8],但是目前大多数研究主要分析土壤基本养分和雅连部分有效成分的关系,并没有关于雅连有效成分和土壤理化指标(土壤中微量元素和土壤基本养分)的综合研究。而土壤中微量元素对雅连乃至整个中药材中都发挥着极其重要的作用,这些土壤理化指标通过影响植物的根系营养、生理代谢活动和化学成分的积累,最终影响中草药的质量[9-10]。【本研究切入点】基于雅连有效成分和土壤因子之间的重要关系,以雅连主产区人工栽培2～5年生雅连及其对应土壤为研究材料,测定18个土壤理化指标和雅连6种生物碱含量;通过相关性分析和冗余分析方法揭示土壤因子与雅连生物碱积累之间的关系。【拟解决的关键问题】本研究筛选出影响雅连生物碱积累的主要土壤因子,为阐明土壤因子对雅连药材质量的影响,进一步实施土壤生态调控提高雅连药材质量,指导药农确定适宜的采收年限提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 供试材料

雅连样品采自四川省眉山市洪雅县瓦屋山镇雅连种植基地,该区域土壤类型以山地黄棕壤为主。选择具有代表性的4个采样基地(表1),每个采样基地分别采集2、3、4和5年生雅连,不同年生雅连分别采集3～8株,同时收集雅连根际土壤样品,并在未种植地块采集相应的对照土壤(CK)。在每个样地中随机选取采样点,将3个采样点混合成一个土壤样品,土壤采集时除去枯枝落叶层,边挖雅莲边取土,去除土壤中的石砾碎屑后,按四分法留样1 kg左右。为确保所有样本具有代表性,2个样点之间的距离大于50 m。共采集植株样48份,土壤样64份(其中有雅连根际土壤样48份,对照土样16份)。将样品带回实验室,根部土壤抖落干净,用刀片将雅连分为主根、须根、叶片和茎并称重记录,然后进行自然风干,粉碎机磨成粉末保存,用于雅连生物碱含量的测定。将土壤样品风干、磨细、过筛(通过2 mm网格筛分均匀)、装袋贴标以备各项指标的测定。

表1 雅连样品来源信息Table 1 Sample information of C.deltoideafrom different regions

1.2 测试方法

1.2.1 雅连生物碱含量测定 供试样品的制备参考《中国药典》2020版本[2],取雅连样品粉末(过二号筛)约0.2 g,精密称定置具塞锥形瓶中精密加人甲醇盐酸(100∶1)的混合溶液50 mL,密塞,称定重量超声处理(功率250 W,频率40 kHz)30 min,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过精密量取续滤液2 mL,置10 mL容量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得雅连生物碱供试样品。

色谱条件用超高效液相色谱仪(WATERS ACQUITY UPLCH-Class,沃特世公司)系统进行测定,色谱条件:色谱柱:Waters BEH C18(2.1 mm×100 mm,1.7 μm,其允许pH范围为1～12);流动相(流动相A∶乙腈∶水=4∶1,SDS含量2 g/L,磷酸含量0.1 mL/L,流动相B∶乙腈∶水=1∶4,SDS含量2 g/L,磷酸含量0.1 mL/L);柱温28 ℃;进样量2 μL;检测波长345 nm;单个样品检测时间为19 min。供试标品均购至上海源叶生物科技有限公司,其中盐酸药根碱对照品(批号:Z05D10X104878,纯度≥98%);非洲防己碱对照品(批号:Y23D11W128338,纯度≥98%);盐酸表小檗碱对照品(批号:DST200410-350,纯度≥98%);盐酸黄连碱对照品(批号:T21S11C125202,纯度≥98%);盐酸巴马汀对照品(批号:Z16J10X79792,纯度≥98%);盐酸小檗碱对照品(批号:S01A10K94340,纯度≥98%)。

测定法参考《中国药典》2020版本[2],分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各2 μL,注入液相色谱仪进行测定,以盐酸小檗碱对照品的峰面积为对照,分别计算小檗碱、表小檗碱、黄连碱、药根碱、巴马汀和非洲防己碱的含量,用待测成分色谱峰与盐酸小檗碱色谱峰的相对保留时间确定。

1.2.2 土壤理化指标测定 土壤和植物TN和C使用元素分析Vario ELⅢ(EA300,意大利欧维特公司)测定,土壤和植物TP、TK采用土壤农化分析方法测定;土壤NH+-N和NON用1 mol/L KCl浸提,全自动流动分析仪(Auto analyzer 3-AA3,德国SEAL analytical)测定,土壤速效磷采用碳酸氢钠浸提-钼锑抗比色测定;速效钾采用乙酸铵浸提-火焰光度法测定;土壤有机质含量为全碳含量×1.724;土壤含水量利用烘干法测定;土壤pH用pH计(SK220,梅特勒-托利多仪器有限公司)测定;以上测定方法参照鲍士旦第三版《土壤农化分析》[15]。

土壤和植物的中微量元素AI、Fe、Mg、Ca、Mn、Na、Zn、Cu使用电感耦合等离子体发射光谱仪测定(Vari-an 710-ES,澳大利亚VARIAN Australia RTY LTD)测定。供试多元素混标夜购至国家有色金属及电子材料分析测试中心。

1.3 数据统计与分析

采用The R Programming Language统计分析软件对64份雅连根际土壤样品中的18个土壤理化指标进行单因素方差分析(ANOVA)和绘制柱状图;对48份雅连主根样品及对应土壤样品中的TN、TP、TK和8种中微量元素进行富集系数分析;采用SPSS 22.0对雅连主根中6种生物碱进行描述性分析;采用The R Programming Language对18个土壤因子和雅连主根6种生物碱进行相关性分析;采用CANOCO 5.0统计软件对15个土壤理化指标和雅连主根6种生物碱进行冗余分析。

2 结果与分析

2.1 2～5年生雅连根际土壤理化指标的比较

2.1.1 2～5年生雅连根际土壤基本养分含量、含水率和pH的比较 由图1可知,不同年生雅连根际土壤的8种基本养分、含水率和pH大部分存在显著差异(P<0.05)。2～5年生雅连根际土壤TN含量依次为2年生>3年生>4年生>5年生,平均值5.343 g/kg,高于国家1级水平(2 g/kg),其中4～5年生降幅最高,为44.309%,2～5年生雅连根际土壤TN的CK(对照土壤)之间均不存在显著差异。不同年生雅连根际土壤TP含量依次为5年生>4年生>3年生>2年生,平均值5.326 g/kg,远高于国家1级水平(1 g/kg),其中3～4年生增幅最高,为99.552%,2～4年生雅连根际土壤TP的CK之间均不存在显著差异,但是均与5年生雅连根际土壤TP的CK间存在显著差异。不同年生雅连根际土壤TK含量依次为5年生>3年生>2年生>4年生,平均值7.841 g/kg,处于国家5级水平(5～10 g/kg),4～5年生增幅最高,为63.777%,2年生和3年生、4年生和5年生雅连根际土壤TK的CK之间均不存在显著差异。

TN:全氮;TP:全磷;TK:全钾;AK:速效钾;SMC:土壤含水率;AP:速效磷;铵态氮;硝态氮;OM:土壤有机质。TN:Total nitrogen;TP:Total phosphorus;TK:Total potassium;AK:Available potassium;SMC:Soil moisture content;AP:Available phosphorus;nitrogen;OM:Soil organic matter.图1 2～5年生雅连根际土壤基本养分含量、含水率和pH的比较Fig.1 Comparison of soil basic nutrient content,water content and pH of C.deltoidearhizosphere soil from 2 to 5 years

2.1.2 2～5年生雅连根际土壤中微量元素含量的比较 由图2可知,多数不同年生雅连根际土壤中微量元素含量具有显著差异(P<0.05),2～5年生雅连根际土壤中9种中微量元素的平均含量依次为Al>Fe>Mg>Ca>Mn>Na>Zn>Cu,2～5年生雅连根际土壤中Al、Fe、Mg、Mn、Na、Zn、Cu的含量在4年生雅连根际土壤含量最低,且含量总体低于其对照土壤(CK);2～5年生雅连根际土壤中钙含量依次为5年生>4年生>3年生>2年生,且4年生雅连根际土壤中Ca含量低于其对照土壤(CK),这与上述土壤中8种中微量元素的变化趋势总体一致。总体来看,2～5年生雅连根际土壤中9种中微量元素含量均较高,且铝和铁元素含量最高,4年生雅连根际土壤中9种中微量元素的含量最低,且其含量低于其对照土壤(CK)中微量元素的含量。

Al:铝;Ca:钙;Cu:铜;Fe:铁;Mg:镁;Mn:猛;Na:钠;Zn:锌(下同)。Al:Aluminum;Ca:Calcium;Cu:Copper;Fe:Iron;Mg:Magnesium;Mn:Fierce;Na:Sodium;Zn:zinc;The same as below.图2 2～5年生雅连根际土壤中微量元素含量的比较Fig.2 Comparison of trace elements contents in rhizosphere soil of 2-5 years C.deltoidea

2.2 2～5年生雅连主根全氮、全磷、全钾和中微量元素的富集系数

由表2可知,不同年生雅连主根对K、Zn、Ca、Cu、Na、Mg、Mn、Fe等元素具有较好的富集作用,其中雅连主根对K和Zn的富集作用最强,K的富集系数最高达3.408,Zn的富集系数为1.477,其它元素的富集系数均小于0.5。从上述整体来看,除Ca和Na元素外,其余7种元素均在4年生雅连主根中的富集系数最高,且4～5年生的富集系数变化最大,其中K元素的变化幅度最大,为67.037%。通过计算不同年生雅连主根中TN、TP和TK的富集系数,得出不同年生雅连主根对TN和TK具有较好的富集作用,富集系数都超过0.5,其中TN的富集系数最高达4.682,TK的富集系数为0.849,对TP的富集系数较低,为0.129。

2.3 2～5年生雅连主根、须根、茎和叶中6种生物碱含量

2.3.1 2～5年生雅连主根、须根、茎和叶中6种生物碱含量分析 由表3可知,6种生物碱大部分均存在显著差异,其中2～5年生雅连主根中6种生物碱总量和小檗碱含量依次为5年生>4年生>3年生>2年生,6种生物碱总量平均值为67.132 mg/g,小檗碱平均值为41.4355 mg/g,6种生物碱总量和小檗碱含量在5年生和4年生之间不存在显著差异,但是均与2年生和3年生之间显著差异(P<0.05)。2020版《中国药典》规定小檗碱含量≥4.5%(≥45 mg/g),可见4年生和5年生雅连主根小檗碱含量均达到了标准,且两者含量相差不多。整体来说,2～5年雅连主根中6种生物碱含量随着种植年限的增加呈逐渐增加趋势,且4年生和5年生雅连主根6种生物碱总体相差不多,表明4年生雅连可能已经合适采收。

表3 不同年生雅连主根、须根、茎和叶中6种生物碱含量Table 3 Contents of 6 alkaloids in taproots,fibrous roots,stems and leaves of different years of C.deltoidea (mg/g)

2.3.2 雅连主根、须根、茎和叶中6种生物碱含量积累量的比较 如图3可知,不同年生雅连主根和茎中6种生物碱含量占比依次均为小檗碱>黄连碱>药根碱>巴马汀>表小檗碱>非洲防己碱;雅连须

图3 雅连主根、须根、茎和叶中6种生物碱含量积累量的比较Fig.3 Comparion of accumulation of 6 alkaloids contents in taproot,fibrous root,stem and leaf of C.deltoidea

表2 2～5年生雅连主根全氮、全磷、全钾和中微量元素的富集系数

Table 2 Enrichment coefficients of total nitrogen,total phosphorus,total potassium and medium and trace elements in the taproot of 2-5 yearsC.deltoidea

元素Element雅连主根Taproot富集系数Concentrationfactor元素Element雅连主根Taproot富集系数ConcentrationfactorTNZ23.849FeZ20.022Z33.816Z30.021Z44.201Z40.032Z56.865Z50.014ZP4.682ZP0.022TPZ20.183KZ23.313Z30.204Z33.019Z40.083Z45.489Z50.048Z51.809ZP0.129ZP3.408TKZ20.877MgZ20.157Z30.748Z30.158Z41.149Z40.395Z50.621Z50.173ZP0.849ZP0.221AlZ20.019MnZ20.131Z30.018Z30.118Z40.026Z40.151Z50.017Z50.074ZP0.02ZP0.119CaZ20.584NaZ20.271Z30.398Z30.237Z40.257Z40.299Z50.286Z50.370ZP0.381ZP0.294CuZ20.400ZnZ21.417Z30.401Z31.559Z40.422Z41.786Z50.242Z51.145ZP0.366ZP1.477

续表3 Continued table 3

根和叶中6种生物碱占比前3的依次均为小檗碱、黄连碱、药根碱,6种生物碱中表小檗碱、巴马汀、非洲防己碱含量排序虽然不同,但是含量整体相差不多,且在6种生物碱总量中的占比低,整体来说,雅连主根、须根、茎、叶中6种生物碱含量部分存在显著性差异(P<0.05);整株雅连中6种生物碱含量占比依次为小檗碱>黄连碱>药根碱>巴马汀>表小檗碱>非洲防己碱;其中小檗碱的占比最高,为56.5%,黄连碱和药根碱占相接近,分别为19.8%和13.7%,巴马汀和表小檗碱占比相接近,分别为4.4%和3.4%,非洲防己碱含量占比最低,为2.1%。

2.4 2～5年生雅连主根中6种生物碱和土壤因子的相关性分析

由图4可知,不同年生雅连主根中6种生物碱含量及其总和与土壤因子具有一定的相关性。药根碱与Na呈极显著负相关(P<0.01);黄连碱与Cu呈显著负相关(P<0.05),与Na呈极显著负相关(P<0.01);小檗碱与AK呈显著正相关(P<0.05),与NO2-N和Na呈极显著负相关(P<0.01)。6种生物碱总量与Na和AP呈极显著负相关(P<0.01),与AK呈显著正相关(P<0.05);综上所述,土壤中的AK对雅连中生物碱的积累具有重要作用,即适当提高土壤中的AK含量,同时适当降低土壤AP和Na含量可以促进雅连生物碱的积累。

2.5 影响2～5年生雅连主根6种生物碱的主要土壤因子分析和筛选

2.5.1 2～5年生雅连主根6种生物碱含量与土壤因子的RDA排序 由表4可知,15个土壤因子变量解释了77.63%的数据总变异,其中第1轴和第2轴的解释率分别为77.59%和0.776%,6种生物碱含量-土壤因子排序轴的相关系数分别为0.952和0.241,第1排序轴的6种生物碱含量-土壤因子关系累积百分比达99.95%,说明其相关系数很高,可解释雅连6种生物碱含量-土壤因子总方差的99.95%,因此,前2个排序轴已能较好地反映雅连6种生物碱含量-土壤因子间的相关关系。

表4 RDA分析排序轴特征值、6种生物碱含量与土壤因子的相关系数Table 4 Correlation coefficients between the characteristic values of RDA analysis and the contents of six alkaloids and soil factors

2.5.2 2～5年生雅连主根6种生物碱含量和土壤因子的冗余分析 如图5所示,黑色箭头表示土壤因子,红色箭头表示雅连叶6种生物碱含量,箭头连线的长短表示各指标对模型贡献率的大小,箭头连线越长对模型贡献率越大,反之,则越小;黑色箭头与红色箭头的夹角表示相关性的大小,夹角越小,相关性越大;而土壤因子箭头(黑色)连线在雅连主根6种生物碱连线上的垂直投影越长(余弦值越大)[13-14],其对雅连叶6种生物碱影响越大。

图5 2～5年生雅连主根6种生物碱含量和土壤因子的冗余分析Fig.5 Redundancy analysis of 6 alkaloids and soil factors in taproot of C.deltoidea from 2 to 5 years

表5 土壤因子贡献率和显著性检验结果Table 5 Soil factor contribution rate and significance test results

3 讨 论

生物碱类化合物是雅连主要活性成份,雅连所表现出来的药用价值与其密切相关,最具代表性的生物碱是小檗碱,此外还有黄连碱等5种,均可作为评价雅连品质的客观指标[15-17]。其生物碱积累与其生长年限密切相关[18],2～5年生雅连主根中6种生物碱总量和小檗碱含量依次均为为5年生>4年生>3年生>2年生,其中5年生和4年生之间不存在显著性差异,但是均与2年生和3年生之间存在显著性差异,5年生和4年生雅连主根中小檗碱含量均符合2020版《中国药典》对小檗碱含量的标准,且含量相差不多,表明4年生雅连可能已经合适采收,本研究结果与岳清洪[19]、陈仕江等[20]相一致。导致4年生和5年生雅连主根中生物碱含量相近的可能原因是,传统川黄连的生产中一般到第5年即收获当年,雅连开始亮棚晒连,以增加地下部分根茎产量[21],即第5年较快的主根生物量积累致使单位重量生物碱含量与4年生相近;另一可能原因是雅连为须根系植物,具有根系浅、数量多的特点,在第5年收货前强光直射会导致根系受损[22],使得生物碱含量减少,导致5年生和4年生雅连主根中生物碱含量相差不多,这与大多数喜阴中药相似,如川贝光照强度过高或者过低都会影响生物碱的含量[23],具体原因还有待深入探讨。

元素的富集系数是指元素在植物体中积累量与其生长土壤中的供给量比值,能客观反映植物对其根际土壤的富集能力[24]。中药材的品质不仅受土壤中大量元素氮磷钾影响,而某些中微量元素对中药材的生长、药效物质的积累及功效的发挥也具有重要作用[25],药用植物对中微量元素的主动性吸收是植物生物体内的基因决定的,但对中微量元素的被动性吸收则是由土壤为主的地质背景这一外部因素造成[26]。通过雅连主根对土壤全氮、全磷、全钾和8种中微量元素的富集系数研究表明,雅连主根对全氮、中微量元素钾和锌的富集作用最强,富集系数分别为4.682、3.408、1.477,对全磷的富集系数较低,为0.129,其它元素的富集系数均小于0.5,此外,相关性分析和冗余分析结果显示土壤中含量较高的速效钾有利于雅连主根生物碱的积累,这与周利等[27]和宋良利[28]的研究结果相似。川黄连中含有相当高的钾元素,从植物生理学的角度来讲,可能与雅连植株具有喜好钾元素有关[29],从中药功效来讲,钾元素在常用的跌打损伤及抗病毒类中药中有重要意义,和中药材有效成分的积累有重要关系[30]。中药材历来有道地性一说,主产区的中药材品质比非主产区的好,这与其气候、土壤、地形和生物因子有关,其中土壤因子极为关键[31],雅连主根中含有较高的钾和氮,且对雅连生物碱积累贡献率也高,这可能是雅连道地性形成的原因所在,可作为雅连道地性药材的特征元素。

药材的品质除了受自身的遗传物质决定外,土壤因子是直接影响雅连等中药材生物量、品质和活性成分的重要因素之一[32]。因此,研究雅连主根生物碱与其土壤因子的相关性,选择适宜的土壤条件进行人工栽培是获得优质药材的保障,以期为雅连人工种植提供科学的施肥指导。相关性分析和冗余分析结果显示,土壤铵态氮含量是影响雅连生物碱积累较重要的因素,与雅连主根生物碱呈显著性相关,占所有土壤因子解释量的比例为8.62%,该结果与雅连对氮具有较高的富集系数相一致,综上得出,4～5年生雅连对铵态氮需求量较高。这可能与雅连生物碱的合成有关,特别是小檗碱是由氨基酸中的酪氨酸经过一定的生源路线形成的次生代谢产物,而4～5年生(采收期)是雅连次生代谢产物高峰期[33]。此外,药根碱可能经小檗碱代谢形成,不同生物碱的合成存在相互依存的关系[34],故氮的缺乏会影响雅连小檗碱和其他生物碱的合成。

特定的逆境条件是道地药材品质形成的前提[35],低磷胁迫可以促进雅连生物碱的积累[19],相关性分析和冗余分析结果显示,雅连主根中小檗碱和6种生物碱总量与土壤速效磷呈极显著负相关,占所有土壤因子解释量的比例为24.62%,是影响雅连生物碱含量最重要的土壤因子,该结果进一步揭示雅连次生代谢产物积累需要低磷供应环境条件[36],这可能是由于药用植物中活性物质的质量和产量受各种环境因素的影响,在低磷条件下,植物活性成分的利用和抗氧化活性显著提高,改变了药用植物的代谢,诱导次生代谢产物的合成,使得生物碱的含量增加[37]。低磷环境促使生物碱含量增加在其它植物中也有发现,如Liu等[38]发现低磷促使铁皮石斛生物碱含量增加。土壤钠含量是影响雅连生物碱积累的又一重要因素,相关性分析显示土壤钠与雅连主根黄连碱、药根碱、小檗碱和6种生物碱总量均呈极显著负相关,占所有土壤因子解释量的比例为15.92%,即钠元素对雅连生物碱积累呈现负向调控,具体机理尚不明确。

4 结 论

在雅连种植地选择过程中,优选氮钾较高、磷钠较低、pH为酸性的土壤,从种植源头筛选雅连的高质化土壤环境条件,在雅连种植过程中,可以通过添加钾肥和氮肥、控制磷肥的施用量和降低土壤中钠含量等农艺措施调控雅连生物碱含量。本研究为实施土壤生态调控,提高雅连药材质量和选择适宜的生长区域提供科学依据,但是雅连的生境因素比较复杂,需要进一步通过既定生境因素的控制性实验才能更加深入地揭示土壤因子对雅连生物碱积累的影响。