十枣汤UPLC指纹图谱化学计量学研究

李文静 ，王艳萍 ，刘荣宏 ，侯玉娇 ，洪博 ，葛鹏玲 刘吉成

1.黑龙江中医药大学，黑龙江 哈尔滨 150040； 2.齐齐哈尔医学院，黑龙江 齐齐哈尔 161006

十枣汤始载于《伤寒杂病论》，由甘遂、京大戟、大枣及芫花4味中药组成，是治疗水结悬饮证的经典方剂，为攻下逐水之峻剂，在泻水逐饮方面有显著疗效[1-2]。临床研究表明，十枣汤在胸腔积液和肝硬化腹腔积液方面有较好的临床疗效[3-6]，用于肝硬化顽固性腹水也有较好疗效[7-8]，但方中甘遂、芫花、大戟的毒性较大，限制了该方的临床应用。

目前关于十枣汤的研究大部分集中在临床应用、药理毒理、单味药化学成分种类和结构方面，而对其药效物质基础研究甚少，且目前尚未见有关十枣汤指纹图谱的研究报道。因此，本研究采用超高效液相色谱法（UPLC）建立十枣汤指纹图谱，指认其药效成分，结合化学计量学方法对不同产地药材制成的十枣汤质量进行比较，为十枣汤的内在质量评价提供参考和依据。

1 仪器与试药

SHIMADZU LC-30AD超高效液相色谱仪（日本岛津公司），METTLER TOLEDO精密天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多集团），KH-500DE型数控超声波清洗器（昆山禾创超声仪器有限公司），TGL-18C-C型台式高速离心机（上海安亭科学仪器厂），SCT型数显搅拌电热套（菏泽市精科仪器有限公司）。

牡荆素对照品（批号190911）、异牡荆苷对照品（批号191218）、巨大戟醇对照品（批号200710）、咖啡酸对照品（批号190503）、瑞香素对照品（批号200209）、伞形花内酯对照品（批号190621）、木犀草苷对照品（批号190721）、槲皮苷对照品（批号191115）、木犀草素对照品（批号190711）、西瑞香素对照品（批号200516）、芫花素对照品（批号200518），北京世纪奥科生物技术有限公司，质量分数均不低于98%。甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯），美国Fairfield试剂有限公司；甲酸（色谱纯），美国Dikma公司；超纯水，杭州娃哈哈集团有限公司。甘遂、京大戟、芫花、大枣均购于其道地产地或主产区，经齐齐哈尔医学院药学院郭丽娜教授鉴定，京大戟为大戟科大戟属大戟Euphorbia pekinensisRupr.的根，甘遂为大戟科大戟属植物甘遂Euphorbia kansuiT.N.Liou ex S.B.Ho的块根，芫花为瑞香科瑞香属植物芫花Daphne genkwaSieb.et Zucc.的花蕾，大枣为鼠李科枣属大枣Ziziphus jujubaMill.的果实。13批十枣汤编号为S1～S13，批号为2020091301～2020091313，配伍药材产地信息见表1。

表1 13批十枣汤配伍药材产地信息

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Waters T3 C18色谱柱（2.1 mm×100 mm，1.7 μm），流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱（0～12 min，10%～15%乙腈；12～16 min，15%～19%乙腈；16～23 min，19%～38%乙腈；23～29 min，38%～80%乙腈；29～35 min，80%～7%乙腈），柱温40 ℃，流速0.4 mL/min，进样量5 µL，检测波长为254 nm。

2.2 溶液制备

2.2.1 十枣汤样品溶液

取芫花、甘遂、京大戟各3 g，大枣10枚（约3～4 g/枚）。芫花、甘遂、京大戟研磨成粉末；大枣放入600 mL水中煎煮，待水约300 mL时熄火，去渣，加入芫花、甘遂、京大戟粉末，即得。按上述方法将不同产地药材制成13批十枣汤样品溶液。

2.2.2 供试品溶液

精密量取“2.2.1”项下十枣汤300 mL，向其中加入无水乙醇700 mL，小火煮至微沸。冷凝回流1 h，冷凝结束后进行脱水抽滤，利用滤纸除去滤渣，加热将滤液浓缩至50 mL，用0.22 µm微孔滤膜过滤，即得。

2.2.3 混合对照品溶液

取各对照品，精密称定，置容量瓶中，加适量甲醇，混合后摇匀，得到浓度分别为巨大戟醇3 mg/mL、咖啡酸10 mg/mL、瑞香素1 mg/mL、伞形花内酯1 mg/mL、牡荆素1 mg/mL、异牡荆苷1 mg/mL、木犀草苷1 mg/mL、槲皮苷1 mg/mL、木犀草素1 mg/mL、西瑞香素2 mg/mL、芫花素1 mg/mL的混合对照品溶液。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验

取同一份十枣汤供试品溶液（S1），按“2.1”项下色谱条件连续进样6次，记录UPLC图，以8号峰伞形花内酯为参照峰（S），计算各共有峰的相对保留时间和相对峰面积的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、伞形花内酯、牡荆素、异牡荆苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留时间RSD分别为0.18%、 0.10%、 0.11%、 0.33%、 0.44%、 1.48%、0.94%、0.40%、0.13%、0.11%、0.08%，峰面积RSD分别为 0.96%、0.96%、0.21%、1.17%、1.59%、0.76%、0.72%、1.03%、1.04%、1.19%、0.21%，结果表明仪器精密度良好。

2.3.2 重复性试验

取制备好的同一批十枣汤样品溶液（S1）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，以8号峰伞形花内酯色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、伞形花内酯、牡荆素、异牡荆苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留时间RSD分别为1.13%、0.77%、0.39%、 0.77%、 1.11%、 0.90%、 1.16%、 1.78%、1.37%、1.47%、0.79%，峰面积RSD分别为0.43%、1.91%、 1.05%、 1.81%、 1.28%、 1.93%、 1.69%、1.83%、0.54%、1.60%、1.86%，结果表明该方法重复性良好。

2.3.3 稳定性试验

取制备好的同一批十枣汤样品溶液（S1），按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件分别于制备后0、2、4、8、12、24 h进样测定，以8号峰伞形花内酯色谱峰为参照峰（S），计算得到各共有峰相对保留时间和相对峰面积的RSD，巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、伞形花内酯、牡荆素、异牡荆苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素和芫花素保留时间RSD分别为1.35%、0.91%、0.27%、0.94%、1.62%、 0.47%、 1.80%、 1.23%、 0.99%、 1.60%、1.45%，峰面积RSD分别为1.87%、1.00%、1.32%、1.02%、 1.37%、 1.10%、 1.82%、 1.79%、 1.02%、0.79%、1.92%，结果表明供试品溶液在室温下24 h内稳定性良好。

2.3.4 指纹图谱建立及相似度评价

取13批十枣汤样品溶液，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定，将数据导入国家药典委员会《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012版），采用中位数法生成对照图谱。共确定31个共有峰，综合考虑峰面积及色谱峰分离度，确定8号峰伞形花内酯色谱峰为参照峰（S），通过与对照品色谱图比对，指认出11个成分，分别为1号峰巨大戟醇、2号峰咖啡酸、4号峰瑞香素、8号峰伞形花内酯、10号峰牡荆素、11号峰异牡荆苷、12号峰木犀草苷、15号峰槲皮苷、23号峰木犀草素、26号峰西瑞香素、29号峰芫花素。见图1。以对照指纹图谱为参照，计算13批十枣汤样品图谱相似度分别为0.958、0.905、0.911、0.955、0.879、0.957、0.941、0.907、0.914、0.924、0.926、0.915、0.906，相似度良好，均在0.85以上，表明所建立的十枣汤指纹图谱质量稳定，可以反映其特征。

图1 十枣汤UPLC图谱

2.3.5 聚类分析

将13批不同产地药材制成的十枣汤样品中31个共有峰的峰面积导入SPSS24.0软件，对13批样品的共有峰的相对峰面积进行系统聚类，采用组间连接法，测量区间为平方欧氏距离，聚类结果见图2。当平方欧氏距离为15时，可将13批十枣汤标准汤剂样品分为2类，其中S1～S3、S5～S13聚为一类，S4为一类。

图2 13批十枣汤样品聚类树状图

2.3.6 主成分分析

将13批十枣汤样品指纹图谱的共有峰峰面积通过SPSS24.0软件标准化处理后，通过降维因子分析，计算特征值、累计方差贡献率，结果见表2。不同产地药材制成的样品中前4个成分的累计方差贡献率为95.100%，能基本反映出样品的主要信息。利用SIMCA-P14.1软件绘制13批十枣汤样品主成分得分图，结果见图3。可以看出，13批不同产地药材制成的十枣汤样品明显分布于上下2个区域，可将样品分为2类，与聚类分析结果基本一致，表明不同产地药材制成的十枣汤的成分存在差异。

表2 不同产地药材制成的十枣汤样品主成分特征值及方差贡献率

图3 13批十枣汤样品主成分得分图

2.3.7 偏最小二乘-判别分析

为进一步比较不同产地药材制成的十枣汤之间的差异，本研究采用偏最小二乘-判别分析（PLS-DA）对不同批次十枣汤样品进行分析。在建立的PLS-DA模型中，R2X和R2Y分别为0.842和0.975，预测能力参数Q2为0.877，表明建立的模型预测能力较好。PLS-DA得分图见图4。13批不同产地药材制成的十枣汤样品被明显划分为2个区域，与聚类分析、主成分分析结果基本一致。

图4 13批十枣汤样品PLS-DA得分图

3 讨论

《本草纲目》言：“十枣汤驱逐里邪，使水气自大小便而泄，乃《内经》所谓洁净府，去菀陈莝法也。”芫花、大戟、甘遂三药均性烈、有毒，逐水泄湿作用能直达水饮窠囊隐僻之处，但可徐徐用之，取效甚捷，不可过剂，泄人真元也。本研究指认的十枣汤中巨大戟醇、咖啡酸、瑞香素、伞形花内酯、牡荆素、异牡荆苷、木犀草苷、槲皮苷、木犀草素、西瑞香素、芫花素成分为主要活性成分，具有攻逐水饮之功效。方中芫花、大戟、甘遂药材的种植产地越来越多，但由于产地的气候条件和地理条件等不同因素，药材质量有所差别，导致十枣汤质量参差不齐。如何尽量减少或避免出现这种现象是目前亟待解决的关键问题，现行的显微鉴别、理化鉴别和含量测定等方法尚无法解决这一问题。建立中药指纹图谱能较全面地反映中药及其制剂中所含化学成分的种类与数量，进而对药品质量进行整体描述和评价。目前，十枣汤质量标准还不够完善，未形成完整、统一、明确的制备工艺和治疗规范，给该制剂的开发和推广造成很大困难。

中药指纹图谱的建立方法有HPLC、UPLC、液相色谱-质谱法（LC-MS）等[9-10]，HPLC仪器分析成本相对较低，但分析时间较长，且有成分存在拖尾现象；LC-MS分析成本较高，不适合广泛推广使用；UPLC灵敏度较HPLC有所提高，且提高了分析效率，使流动相消耗减少，其色谱峰峰形也能较好地呈现出来。因此，本研究采用UPLC建立十枣汤的指纹图谱，有较强的实用性。

前期研究分别对甲醇-水（70∶30）、乙腈-水（65∶35）、0.1%甲酸-水，乙腈-0.1%甲酸水溶液等流动相的组成进行比较，结果表明乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相时，系统的分离效果最好且保留时间更理想，各峰的分离度及峰形都更好。因此，以乙腈-0.1%甲酸水溶液作为流动相进行梯度洗脱。

前期通过查阅文献，分别对柱温38、39、40、41、42 ℃进行了考察，结果表明，当柱温为40 ℃时，色谱峰数量最多，各组的色谱峰与相邻峰分离度均达到要求，各类成分也可得到较好分离，因此选择柱温为40 ℃。

通过前期研究考察，采用DAD在200～400 nm波长范围内进行全波长扫描，并参考芫花、大戟、甘遂及大枣的检测波长，结果发现供试品在254 nm波长处色谱峰数量最多，各峰之间的分离度较理想，故选择254 nm为检测波长。

综上所述，本研究建立的UPLC十枣汤指纹图谱分析方法简单方便、准确、可靠，可有效反映十枣汤的定性特征，能够对十枣汤的质量标准提供参考，可为进一步探究十枣汤的药理作用和临床应用提供依据，也为经典名方的开发和研究提供思路。