干细胞再生工程技术与关节软骨缺损修复

吕子豪，周明旺*，王晓萍，吉星，李盛华

（1 中国融通医疗健康集团有限公司淄博一四八医院，淄博 255399；2 甘肃中医药大学，兰州 730000；3 甘肃省中医院，兰州 730050）

关节软骨由于缺少血管、神经及淋巴系统[1]，且软骨内没有巨噬细胞，损伤后坏死和凋亡的残余物无法清除，抑制组织再生，因而轻微的软骨磨损都会造成不可逆的伤害。关节脱位和半脱位、剥脱性骨软骨炎与慢性退行性改变都会导致关节软骨损伤，这种损伤可单独发生，也可能伴随肢体畸形、半月板、韧带损伤和骨缺损等[2]，因此关节软骨缺损的修复成为骨关节损伤及退行性病变中所面临的一个巨大的难题。抗炎药、关节内注射及矫形支具的使用仅能控制现有的症状，很难达到良好的疗效。

传统的软骨修复手段有软骨钻孔术[3-4]、微骨折术[5-6]、骨膜移植、自体骨或同种异体骨移植[7-9]等，新兴的工程软骨组织[10]、水凝胶复合物辅助修复[11-12]等组织工程技术也逐步被应用于软骨修复治疗之中。随着干细胞研究的快速发展，脂肪组织、骨髓和脐带等分离的间充质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）在软骨修复中显示出更为广阔的前景。

软骨细胞无法产生足够的功能性基质以修复受损软骨是骨关节炎（osteoarthritis, OA）的显著特征之一[13]。以胚胎干细胞（embryonic stem cells, ESC）、神经祖细胞、MSCs 和造血干细胞等[14]为研究对象的再生医学通过细胞疗法、组织工程和基因疗法修复人体功能失调、受损或缺失的细胞、组织和器官，以重现机体正常功能[15]。其中，MSCs 凭借其高增殖能力、软骨分化能力和免疫抑制活性在OA 软骨损伤的再生中发挥了重要作用[16]。目前，在实验动物和人的研究中，以干细胞为基础的疗法在软骨修复方面已具有一定疗效，干细胞与骨组织工程技术相结合也逐步应用于临床，例如3D 打印骨组织工程支架的技术通过负载干细胞起到对骨组织结构修复及诱导干细胞的定向分化和增殖[17]。

1 间充质干细胞的软骨修复作用

MSCs 作为具有中胚层和神经嵴起源的多能基质细胞，可分化成多个细胞谱系并发挥旁分泌作用[18]，给包括骨骼疾病在内的各医学领域带来了许多希望。成骨细胞、体外的软骨细胞、脂肪细胞和肌细胞等通过骨髓、脂肪组织、肌肉、脐带等的MCSs分化而来[19]，进而修复或重建受损骨骼组织。在软骨修复中，骨髓间充质干细胞（bone mesenchymal stem cells, BMSCs）、脂肪干细胞（adipose-derived stem cells, ADSCs）、脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells, UCMSCs）[20]等都显示出了修复关节软骨的潜力，但它们又有着各自的优势。

1.1 骨髓间充质干细胞

BMSCs 是组织工程软骨构建的理想种子细胞之一[21]，它取材方便、易于培养，具有分化为软骨细胞的潜力，并通过分泌生物活性因子以防止软骨的降解。BMSCs 通过多种方式参与软骨的修复，一种载有BMSCs 的3D 生物打印多层支架通过促进胶原蛋白II 和抑制股骨滑车骨软骨缺损中的白细胞介素1β 来促进软骨形成[22]，并显著改善大鼠受伤腿的地面支撑力、爪抓地力和步行步态参数等。TGF-β1或/和CDMP1 诱导BMSCs 表达胶原蛋白II、聚集蛋白聚糖和Sox9[23]，能增强细胞迁移，抑制细胞凋亡，并减轻兔喉软骨缺损，降低特异性软骨基质标志物水平。一种负载BMSCs 的新型动态纳米复合微凝胶组件，可临床注射，其组织粘附性、微孔性及受控药物释放更加优越，可为软骨修复提供更优的微环境[24]。有学者[25]发现使用热敏甘油磷酸酯（GP）研发与聚赖氨酸改性壳聚糖聚合物（SF/PCS）共混的大分子丝素蛋——TGF-β1-SF/PCS 可注射水凝胶与BMSCs 有着良好的生物相容性，在软骨修复的前景中较好。

除了BMSCs 有促进关节软骨再生的潜力[26]，其衍生的外泌体（BMSC-Exos）也可以对软骨的再生起到促进作用。BMSC-Exos 通过人脐带沃顿氏胶促进巨噬细胞向M2 表型的极化，抑制炎症反应进而促进软骨再生，减弱IL-1β 对软骨细胞增殖和迁移的抑制作用[27]。不仅如此，BMSC-Exos 还可减轻软骨损伤，减少骨赘形成和滑膜巨噬细胞浸润，抑制M1巨噬细胞的产生并促进M2巨噬细胞生成[28]。M2巨噬细胞可以产生精氨酸酶-1（arginase-1, ARG-1）和促软骨形成细胞因子（如IL-10、IL-1RA 和TGFβ），BMSC-Exos 通过促进M2 巨噬细胞的形成进而加速软骨修复进程[29]。

由上可知，BMSCs 在软骨修复中多通过生物工程组织架或者生物载体化合物等方式发挥其对关节软骨的修复作用，比较突出的优点是可临床注射及受控药物释放性优越，为药物结合干细胞治疗软骨缺损提供了较为可靠的载体。研究者需进一步明确其作为药物载体的药效释放曲线，以及机体的免疫排异反应情况。此外，由于制备BMSCs 的材料和工艺较为复杂，临床应用仍受到一定限制。

1.2 脂肪干细胞

虽然缺氧状态下BMSCs 显示出致密的软骨形成颗粒和更高的软骨形成潜力[30]，但在OA 的治疗中，ADSCs 相比于BMSCs 更容易获得[31]，它来源更广泛、获取更便捷、免疫原性较低，可以产生最佳数量的软骨细胞修复软骨缺损[32]，因而广泛用于动物实验和临床实践中。

ADSCs 往往通过生物结合技术发挥对软骨修复的作用。ADSCs 不仅可改善膝关节和距骨骨软骨局灶性缺损的软骨再生修复[33]，还能作为颅面软骨缺损或畸形修复的种子细胞[34]。ADSCs 与软骨细胞外基质通过组织工程构建软骨复合物，成功修复猪膝关节软骨缺损[35]。Ma 等[36]通过将ADSCs 加入含TGF-β3 的培养基中与软骨细胞共培养，能促进细胞增殖，增强ADSCs 的软骨分化作用，表明ADSCs 和软骨细胞与TGF-β3 的颗粒共培养可以构建大量软骨。ADSCs 衍生的细胞外囊泡（extracellular vesicle,EVs）与壳寡糖（chitosan oligosaccharide, COS）结合可逆转IL-1β 对软骨细胞活力和迁移的抑制，降低细胞凋亡，促进软骨损伤的修复，并改善OA 症状[37]。ADSCs 还可通过释放多种旁分泌因子和EVs 来维持自我更新和增强多分化潜能，从而修复受损的软骨[38]。另一项研究发现，有双皮质素（doublecortex,DCX）表达的ADSCs 可增加软骨组织中生长分化因子5（growth and differentiation factor, GDF5）和母体蛋白2 的表达，显著增加软骨的修复，可用于治疗局部软骨损伤的软骨组织中[39]。

由此可见，ADSCs 不仅通过释放相关因子改善软骨的修复，还可以作为种子细胞在软骨修复中起到作用。相比于BMSCs，ADSCs 在获取性及免疫原性方面更为优越，可一定程度上解决制备可修复软骨的干细胞材料和工艺较为复杂的问题，减少机体可能发生的排异反应。

1.3 脐带间充质干细胞

人脐带间充质干细胞系（hUCMSCs）与人脐带血间充质干细胞（umbilical cord blood mesenchymal stem cells, hUCB-MSCs）具有比其他干细胞更高的增殖率、更好的稳定性和更大的成软骨潜力[40]，它在人体[41]和动物体内[42]都表现出了低免疫原性[43]及高增殖率[44]，更重要的是由于其来源于脐带，采集过程无创，干细胞供应也更为充足[45]。

在一项针对兔软骨缺损的实验中[46]，hUCBMSCs 不仅和兔骨髓干细胞（rBMMSCs）有着相对一致的治疗方向，而且在软骨缺损修复、组织学分析及生物力学测试中更优于rBMMSCs的作用，对兔软骨修复起到了更好的效果。利用UCMSCs 治疗胶原诱导性关节炎大鼠（CIA）的实验表明，与未治疗的CIA 大鼠相比，UCMSCs 治疗CIA 大鼠的软组织仅轻微肿胀，关节软骨破坏较少，滑膜增生亦不明显，炎症细胞浸润显着减少，且UCMSCs 还通过降低破骨细胞前体的基因表达来减少CIA 大鼠的破骨细胞生成，从而使软骨缺损自发修复不受抑制[47]。由于hUCB-MSC 在关节软骨中的治疗优势，新兴干细胞疗法中将其以复合物的形式投入使用，一种同种异体hUCB-MSC与透明质酸水凝胶复合成的Cartistem干细胞药物，用于OA 受损部位的软骨修复疗效明显[48]。针对老年患者，hUCB-MSC 和4%透明质酸盐复合物（UCB-MSC-HA）的使用在软骨修复等级及疼痛功能改善程度等方面优于微骨折术[49]。碘乙酸单钠（MIA）通过Caspase 3 信号通路诱导细胞凋亡，hUC-MSCs 不仅可以帮助经MIA 处理的软骨细胞减少细胞凋亡，还可以促进透明软骨再生及损伤的修复，进而起到关节软骨保护与修复作用[50]。hUCMSCs 与生物工程结合也逐步被应用，利用沃顿胶（WJ）和硫酸软骨素（CS）复合支架的三维多孔结构优势负载hUCMSCs 在小鼠软骨修复中也展现出了抑制免疫排斥和诱导宿主免疫耐受的能力，且修复后的组织与周围正常组织融合良好，创面光滑完整[51]。

与BMSCs 的外泌体类似，人脐带间充质干细胞小细胞外囊泡（hUCMSC-sEVs）同hUCMSCs 都可以显着影响炎症环境中的软骨细胞活性和基质重塑过程，经过划痕试验表明hUCMSC-sEVs 增强了软骨细胞的迁移，且与hUCMSCs 相比更有效地增加软骨细胞的运动性，修复的关节面也更为光 滑[52]。

作为新兴干细胞疗法中的一员，hU-MSCs 因其增殖性和稳定性更强，且其采集过程无创、简便而在治疗中被更多的选择。hUCMSCs 不仅可以促进软骨的再生，还影响破骨作用，在软骨修复等级及疼痛功能改善方面也优于普通手术治疗。

2 胚胎干细胞

胚胎干细胞（ESC）来源于囊胚期的内细胞团，具有无限增殖和胚层分化的潜力，一直是组织工程和再生医学研究的重点。有研究发现[53]，hESC 衍生的软骨细胞与膜结合产生的BMP-2 等分泌蛋白可以促进BMSCs 诱导关节软骨形成，并且经该结合物处理后的软骨缺损部位在生物力学方面表现出了优于仅膜处理的软骨缺损部位，瞬时弹性模量也更高，产生的修复组织更类似于天然软骨，可长期修复缺损的猪透明软骨的功能。Gardner 等[54]发现hESC 衍生的关节软骨除修复大鼠滑车关节软骨外，单个软骨植入物还有可能促进新软骨下骨的生成。来自hESC的软骨形成细胞在小鼠皮下植入后保留了稳定的软骨形成表型[55]，即使植入的细胞和小鼠宿主细胞在区域上有界限，但在基底和侧面与宿主组织结合良好。其中一部分植入物经历了类似于软骨内骨化的重塑过程，这也表明了单一软骨植入物不仅可以修复关节软骨，还可能促进新软骨下骨的生成[54]。在植入裸鼠髌骨沟的骨软骨缺损处时，与软骨形成相关基因表达上调，促进了软骨修复[56]。源自人ESC的软骨细胞对损伤的软骨进行修复后，I 型胶原蛋白染色情况与天然软骨类似，且与仅植入纤维蛋白的对照组相比，软骨形成细胞的修复得到了显著改善[57]。这些研究表明了缺损的软骨在植入hESC 衍生的软骨细胞后，通过增强的软骨形成起到修复缺损软骨的作用。

尽管如此，从hESC 中获得功能性软骨细胞[58]仍较为困难，并且其牵扯到的伦理问题也很突出，免疫排斥反应也较强，若要应用于人体，必须进行软骨关节炎症程度的评估和其他全身性疾病的筛查或排除[53]，这使得ESC 在临床上的应用受到了较大限制。

3 诱导多能干细胞

诱导多能干细胞（iPSC）通过导入特定的转录因子将终末分化的体细胞重编程为多能性干细胞，与原代软骨细胞的间接共培养可以直接诱导软骨细胞的形成[59]。Guzzo 等人[60]研究发现iPSC 可增强软骨形成能力，且较其他细胞相比更为优越。iPSC相比于ESC，来源限制就相对小很多，并且iPSC 可以克服形成骨骺或肥大软骨的问题[58]。iPSC 倾向于产生具有胚胎特征的细胞，这将为获得具有类似软骨自我修复活性的细胞提供机会[61]。iPSC 来源的人骨骼干细胞（hSSC）会向软骨偏向分化[62]，为软骨的修复提供支持。免疫原性方面，iPSC 具有一种免疫原性特性，而这种特性在干细胞进行软骨修复时发挥一定的作用[63]，且iPSC 与其他干细胞相比具有更有效的免疫调节作用，从hiPSC 获得的软骨祖细胞也表现出MSCs 的免疫表型特征[64]。通过iPSC（或ESC）的单层培养物首先分化为中内胚层，然后进一步分化为软骨形成培养物，这是最接近自然发育的诱导人类软骨分化的方法[65]。

虽然iPSC 没有ESC 的伦理限制和免疫原性影响，但不可忽视的一点就是其临床应用成本高昂，而且很难制备无遗传修饰的iPSCs，不仅如此，iPSCs临床应用的安全性也有待研究。这些问题限制了iPSCs的发展，但同时也为我们的研究指明了方向。

4 小结与展望

软骨缺损的治疗和修复作为世界性医学难题，一直困扰着我们，如何对软骨进行精准修复还未有十分明确的方案，应用干细胞治疗关节软骨缺损更是学者们研究的焦点。BMSCs 取材方便、易于培养；ADSCs 与BMSCs 相比来源更广泛、获取便捷、免疫原性较低；hUCMSCs 与BMSCs 相比有更高的增殖率、更好的稳定性；ESC 因受限于伦理问题，获得性较差，加上免疫排斥反应，限制其在软骨修复中的应用；iPSC 克服了BMSCs 骨骺形成及肥大软骨生成问题，但其临床成本过于高昂。除此之外，滑液来源的间充质干细胞（SF-MSCs）[66]、外周血来源的祖细胞[67]也属于干细胞治疗软骨缺损的一个范畴。如何为关节软骨缺损的医疗修复提供廉价、便捷、优效的方案，克服干细胞来源问题，摆脱干细胞应用于疾病治疗时遇到的技术瓶颈，避免干细胞在应用过程中产生的免疫排斥反应，以及结合生物组织工程学后怎样保证干细胞稳定性的问题，细胞应用于人体的生物安全性问题，都是需要我们做进一步研究及讨论的难点。

我们应该结合再生医学、生物工程学、组织工程等多个学科进行干细胞的应用研究，从生理层面、病理层面及对软骨修复的效率等多方面开展人体及动物实验研究，为干细胞在软骨修复中的应用提供更好的理论技术支持。尽管干细胞的高分化能力给予软骨修复一定程度的帮助，但因其准确性不佳、价格昂贵，仍无法广泛投入临床实践应用中。软骨修复辅助蛋白因子受潜在的蛋白质不稳定性的限制，高剂量的蛋白质可能带来不利于机体的副作用，水凝胶复合物就此应运而生。干细胞通过结合水凝胶复合物，从而在软骨修复等疾病中克服细胞自身生理特性的局限与蛋白质不稳定性的限制，这项技术给了我们一定的启发，随着组织工程技术[68]、细胞膜片技术[66]、3D 打印工程支架技术[69]等多种技术的发展，干细胞结合上述几项技术应用于软骨修复可以避免干细胞不同种类本身所带来的局限性，提高软骨修复效率，降低损伤性和排异性，通过选择最优种类干细胞结合相关生物组织工程学技术而实现利用性最大化。

目前，我国实施“健康中国战略”，干细胞技术与再生医学结合应用是落实该战略部署的一个重要武器之一，应用于软骨损伤的修复治疗前景无限，但研究对象多为动物，在人体内实验方面还较为空白，是我们进一步研究的方向和重点。