外阴阴道念珠菌病病原体检测方法研究进展

刘伊诺 姜伟伟 潘炜华

(海军军医大学第二附属医院皮肤科 上海市医学真菌分子生物学重点实验室,上海 200003)

外阴阴道念珠菌病(vulvovaginal candidiasis,VVC)是一种由念珠菌感染引起的生殖道感染性疾病,是目前导致阴道炎的第二大常见病因,占17%～39%[1]。在我国,白念珠菌约占VVC致病菌种的70%～90%,是VVC的主要病原体,其次为光滑念珠菌,占4%～20%,克柔念珠菌、近平滑念珠菌和热带念珠菌也可引起VVC[2]。目前,直接镜检是临床诊断VVC最常用的方法,但由于直接镜检敏感性较低,无法明确菌种,因此临床亟需快速、准确的病原学检测方法来提高VVC的早期、精准诊断。

2021年德国发布的一项指南指出[3],VVC确诊需结合临床表现和真菌镜检结果,镜检阴性时应进一步完善分泌物的培养鉴定。近年来,随着分子生物学技术的不断发展,DNA分子测序能够快速、准确地将病原真菌鉴定至种的水平,其中ITS1/4等对念珠菌的鉴定敏感性高达90%以上[4]。本文结合目前已有研究对VVC病原体检测方法进行综述。

1 直接镜检

阴道分泌物涂片镜检是诊断VVC常用的实验室检测方法,镜下查见卵圆形芽孢、孢子和/或假菌丝为阳性,但灵敏度欠佳,其准确率常与实验室检测人员的经验密切相关。直接镜检阳性可作为确诊VVC感染的重要指标之一,但缺点是不能将病原真菌精准鉴定至种的水平。真菌荧光染色可提高样本检测阳性率,使用液基真菌富集制片靶向荧光染色法能进一步降低对检验人员的要求,从而提高真菌镜检的准确率[5]。Momenzadeh等[6]研究表明,通过计算机辅助诊断软件(computer-aided diagnosis software,CAD)处理显微镜图像,能够提高诊断准确率,节省诊断所需时间和成本。杜晓辉等[7]通过一种基于改进区域卷积神经网格(region-based convolutional neural networks,R-CNN)目标检测算法实现了分泌物样本显微镜图像中念珠菌等有型成分的检测,算法综合检测时间233 ms,为实现VVC感染的智能识别提供了理论基础。周泉等[8]的一项研究表明,人工智能领域样本稀释机器人可以将待测样本稀释到适宜浓度,以便于检验人员观察,从而提高VVC感染的诊断效率及准确率。

2 核酸检测

2.1 聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)

聚合酶链反应能够在短时间内将目的基因与DNA片段进行快速扩增,PCR技术应用在VVC检测的局限性主要在于缺少规范化的统一检测标准和多中心的临床研究验证[9]。多重PCR可用于检测多种细菌、毛滴虫以及6种念珠菌等引起的阴道炎病原体,其敏感性和特异性达90%以上[1]。SeegeneAllplexTM是一种多重实时PCR检测技术,可同时识别和定量7种微生物,用作念珠菌相关检测时可自动将念珠菌属分为白念珠菌和非白念珠菌(non-albicansCandida,NAC),检测时长小于5 h。 Vieira-Baptista等[10]开展的一项750例单中心临床诊断阴道炎的横断面研究表明,SeegeneAllplexTM对念珠菌的敏感性为91.1%,特异性为95.6%,其中对NAC的敏感性和特异性较高,分别为100%和97.5%。Aptima©CV/TV是一种基于转录介导扩增法(transcription-mediated amplification,TMA)而开发的检测试剂盒,可用于检测特定的念珠菌种属,敏感性为85%～92%,特异性可达95%～99%[1]。

实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR,RT-qPCR)最早由Higuchi等[11]提出,随后美国PE(PerkinElmer)公司研发出了TaqMan荧光探针定量技术,真正实现了“即时检测”。与传统的PCR技术相比,荧光探针定量技术具有特异性高、可重复性好、操作简单等优点。杜笠等[12]的一项研究报道显示,实时荧光PCR定性法对生殖道念珠菌检测的灵敏度和特异度分别为100%和97.45%,目前可用于白念珠菌、光滑念珠菌和热带念珠菌等的检测。

2.2 DNA探针法

DNA探针法以核酸杂交原理为基础,对使用与病原体特有基因序列互补的两个单链核酸探针(即捕获探针和显色探针)进行快速检测。对于目标病原体,探针分析卡中分别包含一种单独的微球,显色探针包含在多孔试剂板中,将捕获探针固定在嵌入探针分析卡的微球中。杂交完成后通过显色试剂显色确定是否存在病原体感染。该方法操作简单,1 h内即可报告检测结果,通过设定检测念珠菌的阳性阈值,可有效避免念珠菌培养假阳性结果。2021年李韬等[13]的一项研究表明,应用BD AffirmTMVPⅢ DNA探针法检测阴道念珠菌的灵敏度为82.26%,特异度为97.00%。在混合感染和疑难病例的检测中BD AffirmTMVPⅢ DNA探针法有较高的临床应用价值[14]。

2.3 环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)

LAMP是一种特殊的核酸检测方法,在等温条件下即可快速、特异地扩增DNA靶标。肖晶晶等[15]以白念珠菌RPSO基因为靶基因建立LAMP体系进行检测,发现LAMP法对VVC病原体检出的灵敏性和特异性分别为87.62%和88.33%,与PCR及分泌物的真菌培养有较好的一致性。2021年黄国亮等[16]研发了叠氮溴化丙锭(propidium monoazide,PMAxx)和LAMP联合的检测方法和一种能够量化阴道分泌物活菌的便携式微流控芯片系统,用于评估抗真菌治疗疗效。

3 抗原检测

免疫层析法(immunochromatography test,ICT)是一种基于免疫胶体金的技术,检测流程仅需3 ～20 min[17]。首先将IgM单克隆抗体固定于硝酸纤维膜的某一区带,当干燥的硝酸纤维素膜一端浸入加有标本处理液的分泌物标本后,由于毛细作用,标本沿着该膜向前移动,当移动至固定有抗体的区域时,标本中念珠菌的甘露聚糖表位抗原与该抗体发生特异性结合,通过免疫胶体金使该区域显示相应颜色,从而实现特异性的免疫诊断。Marot-Leblond等[18]2009年研发了一款利用ICT快速检测VVC的试剂盒,在其研究纳入的205例患者中,ICT法的敏感度高达96.6%。莫翼军等[17]对中国宁波市第一医院的440份临床样本进行研究,发现ICT法的灵敏度为82.7%,高于镜检法(64.0%)。

4 其 他

基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS)是近年来新兴的一种新型的软电离生物质谱,已广泛应用于多肽、蛋白质、低聚核苷酸及低聚糖等,可作为替代生化和分子鉴定的可靠方法[19]。通过将培养得到的待测菌株的蛋白质谱图与数据库中已知真菌的参考谱图对比后可得出鉴定结果,具有耗时短(3～5 min)、成本低、高通量、准确性高的特点,对念珠菌的特异性达90%以上[20]。MALDI-TOF质谱仪价格昂贵,但与现有技术相比,其高识别率有一定的应用价值[21]。

5 总结与展望

VVC是育龄期女性常见的生殖道真菌感染性疾病,严重影响患者身心健康。目前对阴道分泌物进行检测的方法在传统的镜检和培养基础上有了新的发展和突破,核酸和抗原技术进一步提高了分泌物检测的准确性,人工智能等先进技术的研发和应用可以使VVC病原体的检测更加快捷和准确,能够有效减少漏诊和误诊率。在临床筛查中,阴道分泌物镜检是首选检测方法。当镜检无法明确或患者病情反复时可进行培养、核酸或抗原检测。TMA、RT-qPCR、LAMP及ICT等检测方法的应用实现了VVC的 “即时检测”。综上,加强VVC快速、准确、智能诊断方法的研究是其临床防治的关键。