Nrf2抑制氧化应激对放射性组织纤维化的作用研究进展

郎家婵 张霓霓 黄桂林 龙远铸

目前,放射治疗(放疗)是各种癌症的主要治疗方法,大约有50%以上的癌症患者需要单独或与手术、化疗、免疫治疗等结合放射方法治疗[1]。然而,多达95%的放疗患者可能会因为暴露于放射而给正常组织带来短期和长期的不良反应[2]。放射性组织纤维化是放疗的长期不良反应,严重威胁到肺、心脏、皮肤、肠道以及唾液腺等。另外,组织纤维化还降低了抗癌药物在放化疗和免疫治疗中对肿瘤微环境的渗透[3]。放射诱导产生的过量自由基和活性氧类物质(ROS)引起氧化应激反应,在炎症和纤维化介质的上调中起关键作用[4]。核因子E2相关因子2(nuclear factor-E2 related factor 2,Nrf2)通路在细胞氧化还原稳态和激活该途径是对抗氧化应激的主要防御机制之一[5]。Nrf2的激活将有助于中和放射产生的ROS,促进受损DNA的修复,减少氧化应激,从而保护细胞免受放射诱导的细胞毒性损害[6]。相关文献报道,放射后的抗氧化治疗显著降低动物模型中的放射性组织纤维化[7]。近年来,已有大量研究报道Nrf2通过抑制ROS的产生和调节其他抗氧化因子的表达来发挥抗纤维化作用[8,9]。因此,Nrf2可能是预防放射性组织纤维化的有效因子。本文对近年来Nrf2在氧化应激和放射性组织损伤防治中的作用研究进行综述。

1 氧化应激与放射性组织纤维化

放射性组织纤维化是放疗的晚期效应,通常发生在放射治疗后4～12个月,并持续数年[10],其机制类似于伤口慢性愈合过程的机制。最初的损伤引发导致炎症的急性反应,随后是成纤维细胞的募集和细胞外基质沉积的激活。放射性损伤由放射诱导的直接DNA损伤和间接机制引发,间接机制涉及电离辐射与水分子相互作用产生ROS和氮物质RNS[11]。后者在放射性组织纤维化中更为突出,ROS可以促进肌成纤维细胞的增殖,从而导致胶原蛋白和纤维蛋白在细胞外基质中沉积[12]。在正常生理代谢过程中,细胞内的ROS是线粒体中电子传递链(ETC)和细胞质区室中NADPH氧化酶家族的副产物,是调节许多细胞过程的重要信号分子,适度水平的ROS有益于细胞增殖和宿主防御[13]。电离辐射促进ETC的电子泄漏并破坏ROS的酶清除剂,例如抗氧化剂N-乙酰半胱氨酸(NAC)、谷胱甘肽过氧化物1(GPX1)和超氧化物歧化酶2(SOD2),导致产生大量ROS[14]。过量的ROS或这些酶的缺乏会进一步加重氧化应激,ROS的氧化能力可以破坏细胞内DNA的合成和修复、线粒体功能和抗氧化酶[11],如果未能修复,这些损伤可能导致细胞突变并促进肿瘤恶化[15]。

由放射诱导的ROS的连续产生可以激活信号传导途径以产生导致组织损伤和纤维化的纤维化形成因子。已有动物模型显示ROS对肺纤维化的形成和发展至关重要[16]。ROS可以介导TGF-β1的产生和活化,促进炎性因子和细胞因子的释放,减少抗氧化防御,促进胶原沉积,表明ROS形成和降解的紊乱是常见纤维化途径的关键部分[17]。低水平的ROS可以作为应激反应机制的激活剂,但放射诱导产生的过量ROS会导致内源性氧化还原动态平衡的破坏,通过诱导抗氧化酶作为Nrf2/ARE信号通路下游因子的基因表达清除过量的ROS[18]。与野生型成纤维细胞相比,Nrf2缺陷的成纤维细胞具有相对较高的活性氧基础水平,在辐射暴露后5 d,ROS水平大大增加[19]。研究报道,鞘氨醇激酶抑制剂通过诱导Nrf2/ARE赋予放射抗性,激活抗氧化防御系统和DNA修复途径来改善放射诱导的氧化应激和细胞毒性损伤[20]。

2 Nrf2及在各器官放射性组织纤维化中的作用

2.1 Nrf2及其生物学特性 Nrf2属于CNC碱性亮氨酸拉链转录因子家族的成员[21],与Nrf1和Nrf3一起,Nrf2属于该转录因子家族的1个亚组。人类的Nrf2蛋白长605个氨基酸,包含7个高度保守的区域,即Neh1～Neh7[22]。Neh1在C端含有bZip序列,通过与细胞核内的Maf蛋白形成异二聚体[23]。Neh2是Nrf2主要的调控结构域,含有2个维持稳定性的ETGE和DLG基序结合位点以及7个主要负责泛素化的赖氨酸残基[24]。Neh3位于Nrf2的C末端,具有高度保守性,与细胞的转录活性密切相关。Neh4和Neh5位于Neh1和Neh2之间,是反式激活结构域,它们与CREB结合蛋白协同结合并增强Nrf2的转录活性[25]。Neh6结构域在Nrf2中间含有大量的丝氨酸残基,对Nrf2具有不依赖于Keap1的负性调控作用[26]。Neh7结构域通过与视黄酸X受体α(RXRa)直接相互作用抑制Nrf2转录活性[27]。

Nrf2通路调控超过500个基因的表达,其 游靶基因控制细胞抗氧化反应、细胞保护、编码转运蛋白以及解毒酶基因的表达[5]。Nrf2调控的抗氧化酶和解毒酶主要包括:谷氨酰胺半胱氨酸连接酶(GCL)、谷胱甘肽S-转移酶(GST)、SOD、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)、γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(γ-GCS)、醌氧化还原酶(NQO1)、血红素加氧酶1(HO-1)等[26,28]。Nrf2信号通路通过上调多种药物代谢酶的表达来清除ROS,以此来发挥重要的抗氧化应激作用[28]。

Nrf2/Keap1/ARE通路是调控抗氧化因子最重要的內源性保护系统之一[21],广泛参与氧化应激诱导的肺、心、脑、肝、肾和神经系统等组织损伤,可保护细胞蛋白和DNA免受ROS和亲电试剂引起的氧化损伤。静息状态下,Nrf2与Keap1相偶联,形成Keap1-Nrf2复合物,被Cullin3(Cul3)-Keap1泛素连接酶复合物快速泛素化,并通过蛋白酶体途径降解,导致Nrf2无法进入细胞核发挥转录因子作用[24]。然而,在化学物质、亲电子或氧化刺激的情况下,Keap1上的半膀氨酸残基被化学修饰[21],特别是Cys151、Cys226、Cys273和Cys288,导致构象改变并削弱与Nrf2的相互作用,从而抑制Nrf2泛素化。Nrf2经历了磷酸化并移位到细胞核[6],与ARE结合诱导抗氧化酶和第二阶段解毒酶[29],提高机体抗氧化应激能力。在Nrf2基因缺失的小鼠细胞内的抗氧化保护基因以及Ⅱ相解毒酶表达显著下降[30]。在衰老的人类成纤维细胞中,通过诱导剂刺激Nrf2介导的蛋白酶体激活,降低ROS水平和提高细胞在氧化应激后的存活率,以及延长寿命[31]。在早期阶段,Nrf2维持氧化还原稳态并调节细胞生长以防止癌症发生。然而,Nrf2的持续激活不仅可以抑制癌细胞凋亡,还可以促进癌症干细胞的自我更新以及化疗耐药性[32]。

2.2 Nrf2在各器官放射性组织纤维化中的作用

2.2.1 肺部:放射性肺纤维化在治疗后数月至数年的时间呈进行性发展,是不可逆转的,可导致肺功能的永久性损害。当放射诱导的ROS和RNS的过量产生会触发细胞氧化应激和炎症,可破坏脂质、蛋白质、DNA,被认为是放射性肺纤维化中涉及的炎症事件的关键起源[33]。Tian等[34]研究表明,敲除Nrf2基因的小鼠胸腔X射线照射后,血清中的抗炎因子白细胞介素IL-10和抗氧化蛋白酶水平降低,而促炎因子IL-6、干扰素-γ、肿瘤坏死因子等均水平升高,肺部炎性细胞浸润增多,导致诱发肺部炎症和急性肺损伤。研究报道,铁死亡抑制剂liproxstatin-1通过激活Nrf2通路下调小鼠肺中TGF-β1、炎性因子水平,提高谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)和NQO1的表达,减少ROS损伤和缓解放射性肺纤维化[35]。Cao等[36]发现小鼠肺组织以及肺泡上皮细胞中Sirt3蛋白表达增加的同时,Nrf2的活性也显著升高,最终放射性肺损伤的早期炎症反应和晚期纤维化均得到明显改善。在一项小鼠放射损伤模型实验中[37],利用沙利度胺(THD)激活Nrf2,导致小鼠体内TGF-β/Smad3信号通路的抑制和放射性纤维化的减弱。而在Nrf2缺失的小鼠模型却未观察到THD的放射防护作用。孙万良[38]发现表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(EGCG)通过上调大鼠肺组织细胞内Nrf2、HO-1、NQO-1的表达水平,激活Nrf2/ARE信号通路,增加Ⅱ相解毒酶和下游抗氧化酶基因的表达,清除机体内氧自由基,抑制肌成纤维细胞的转化和增殖,改善肺组织炎性反应和纤维化病变。Ebrahimpour等[39]研究表明,埃索美拉唑通过促进Nrf2核入位和诱导HO-1表达来控制促炎症和促纤维化分子,进而发挥抗肺纤维化作用。Traver等[9]对小鼠进行12 Gy/d放射剂量,通过组织学评估显示发现Nrf2缺失的小鼠对放射诱导的肺损伤敏感性是野生型小鼠的1.6倍,更易产生组织重塑和胶原沉积。该实验研究证实Nrf2缺失使肺泡Ⅱ型细胞上皮-间充质细胞向肌成纤维细胞的转变,增加了放射介导的肺组织重塑和胶原沉积,而上调Nrf2可增强肺内组织抗氧化能力,从而减轻放射诱导的氧化损伤和纤维化。综上,Nrf2信号通路通过抑制氧化应激对放射性肺纤维化确实有保护作用。

2.2.2 肝脏:肝脏在受到放射线照射时会发生一系列生理、病理变化,从而限制放射治疗疗程或发展为严重的慢性副作用,如放射性肝纤维化。氧化应激是肝纤维化进展中的一个主要促纤维化因素[40],在很大程度上归因于ROS的大量产生和抗氧化能力的减弱。Nrf2作为关键的抗氧化转录因子,通过促进多种抗氧化基因的表达来保护细胞免受氧化应激,在肝细胞中具有抗炎和细胞保护作用[41]。成纤维细胞生长因子10(FGF10)通过介导Nrf2激活促进肝脏中的抗氧化反应,有助于肝脏修复[42]。然而在Nrf2敲除小鼠中,FGF10过表达未能保护肝脏免受坏死、肝细胞凋亡和炎性反应。Liu等[43]在关于藻蓝蛋白(PC)对小鼠放射肝损伤的保护作用实验研究中,6 Gy全身X线照射导致小鼠肝脏组织发生了病理变化,与未加PC处理的小鼠相比,PC处理的小鼠组织学损伤明显减轻。该实验发现其作用机制是PC通过激活Nrf2/HO-1通路,提高Nrf2蛋白的表达,减少氧化应激,修复DNA损伤,从而减缓放射导致的肝组织损伤。桑椹素(MUL)通过改善TRIM31/Nrf2信号通路抑制NF-κB和NLRP3炎性小体的表达和释放,缓解炎性反应和ROS的积累,有效阻断肝星形细胞(HSCs)活化和抑制肝纤维化[8]。HO-1是Nrf2/ARE信号通路下游的重要抗氧化蛋白,其高表达可显著降低多种炎性反应,有效缓解肝组织损害。Mamdouh等[44]在γ辐射大鼠诱导的肝损伤中,发现姜黄素通过增强激活Nrf2,调控Nrf2/HO-1信号通路改善促炎细胞因子的表达,抑制肝脏炎症。YAP(Yes-associated protein)效应因子在肝脏保护、修复、再生和纤维化中的作用已被描述[45]。值得注意的是,在Nrf2缺乏的肝脏中激活YAP却未能保护肝细胞免受炎症损伤,导致广泛的纤维化。以上研究结果都表明Nrf2的高表达可以对放射治疗中的肝损伤具有肝保护作用,有效抑制肝纤维化的形成。

2.2.3 皮肤:皮肤作为放疗进入机体的必经之路,皮肤会在第一时间受到射线的刺激。皮肤中的中性粒细胞被进一步刺激并释放促炎细胞因子,使炎症持续并增加ROS的形成,造成组织严重的氧化损伤和组织纤维化的形成,致使皮肤老化,甚至癌症的发展[46]。故而,有效的抗氧化防御策略对皮肤也至关重要。Nrf2信号通路的内部或系统激活会产生级联效应,是调节皮肤损伤或炎症后抗氧化酶表达的核心角色,在皮肤稳态、修复中有着重要作用[26]。Knatko等[47]研究发现,在健康人体受试者中,局部使用含有Nrf2激活剂萝卜硫素的提取物,可有效降低紫外线辐射引起的皮肤损伤,证明Nrf2的小分子激活物可以保护辐射诱导的损伤在细胞和体内。Xue等[48]在关于Nrf2调控GCH1对放射引起的细胞衰老程度影响的小鼠实验中,发现与未照射小鼠组比较,照射组中细胞衰老程度明显增加,同时过表达Nrf2组的阳性细胞数目明显降低,起到缓解皮肤衰老的作用。Nrf2在保护皮肤细胞免受紫外线照射方面扮演着重要作用,如UVA诱导的细胞凋亡在Nrf2缺陷的小鼠皮肤成纤维细胞中强烈增强,然而Keap1敲除小鼠的成纤维细胞对UVA诱导的细胞凋亡只有部分保护作用[49]。在创面修复过程中,Nrf2表达活性增加可刺激上皮细胞的增殖和迁移,抑制细胞凋亡[50]。Wang等[51]在通过敲除Nrf2来研究虫草素对成纤维细胞的影响放射性损伤皮肤实验中,发现虫草素以keap1依赖的方式激活Nrf2,增加Nrf2的入核表达来防止细胞衰老,提示虫草素诱导的细胞衰老和抑制炎症表达都是依赖Nrf2。研究发现,在含有萝卜硫素治疗的放射小鼠组中的纤维组织增生明显少于对照组[52]。证实萝卜硫素通过激活Nrf2的表达和功能,上调HO-1和CAT在内的抗氧化酶,抑制ROS的产生来阻断NLRP3炎性小体的激活和DNA损伤,促进小鼠的放射性皮肤损伤修复。

2.2.4 唾液腺:放疗是治疗头颈部癌最常用的手段之一。唾液腺由于自身特殊的解剖位置,常暴露于辐射区,便不可避免的出现唾液腺功能减退,如放射性唾液腺炎、口腔黏膜炎、放射性颌骨骨髓炎等,严重影响患者的生活质量。因此对放射性唾液腺的机制研究以及预防和保护唾液腺已成为重要的研究方向。Wati等[53]研究报道,通过Nrf2/Keap1信号通路的激活可减弱小鼠颌下腺中胶原沉积、免疫细胞浸润、DNA损伤和凋亡,缓解氧化应激,改善纤维化的形成,提示Nrf2的激活对唾液腺具有抗衰老作用。Matsuoka等[54]研究证明,在口腔鳞状细胞癌中,IL-6通过促进Nrf2信号通路抗氧化途径的激活,进而增加抗氧化因子的表达水平,有效抑制放射诱导的细胞死亡以及控制癌细胞的抗辐射能力,从而提高患者生存率。张思琴等[55]在研究海带多糖(LJP)对放射诱导下颌下腺氧化损伤的保护作用中,与对照组比较,给予LJP干预的放射小鼠组中颌下腺中的Nrf2,HO-1和NQO1蛋白含量进一步增加,提示LJP可能通过诱导激活Nrf2信号通路,增强其抗氧化能力,从而改善颌下腺组织的氧化应激损伤和炎性反应,有效减缓颌下腺放射组织的纤维化形成。

2.2.5 其他组织:慢性放射性肠炎的发病率为5%～55%[56],其主要特征表现为肠壁纤维化、肠黏膜萎缩、血管硬化及肠腔狭窄或穿孔等组织病变。原花青素B2在小鼠受放射肠道损伤后通过Nrf2/ARE信号通路抑制氧化应激促进肠道再生和修复[57]。研究报道,EGCG通过Nrf2信号通路清除ROS,激活Nrf2下游靶蛋白SIc7A11、HO-1和GPX4,抑制细胞凋亡和铁细胞死亡,从而延长了照射小鼠的生存时间以及有效减缓了放射诱导的肠黏膜损伤[58]。Nrf2能够与TGF-β相互作用,参与了包括肠道在内的许多器官的纤维生成过程[59]。Guan等[60]研究发现,用tBHQ处理小鼠慢性纤维结肠炎模型、以及用tBHQ或si-Nrf2预处理人肠成纤维细胞后,然后采用TGF-β1刺激转化,通过检测纤维化指标和细胞内ROS水平表明,tBHQ能通过抑制TGF-b1/SMADs信号通路进而减缓小鼠结肠炎和人肠成纤维细胞纤维化,而Nrf2缺失可促进TGF-β1诱导的肠成纤维细胞分化。其实验结果表明,Nrf2在体内外均通过阻碍ROS/TGF-b1/SMADs通路来抑制肠纤维化。Seemann等[61]研究结果显示,采用2.0、8.0 Gy的X射线对小鼠进行局部心脏放射后,可引起小鼠轻度延迟性心脏纤维化并降低毛细血管密度。橙花醇通过调节大鼠急性心脏毒性中的Nrf2/Keap1信号通路传导,抑制炎症介质和NF-κB/MAPK活化的改善,减轻氧化应激、炎症和细胞凋亡[62]。已发现左旋肉碱通过激活p38MAPK/Nrf2信号通路诱导和NQO1的表达,抑制暴露于辐射心脏中活性氧的产生和细胞凋亡来减轻心脏功能的丧失[63]。研究报道,Ghrelin通过上调Nrf2,阻碍NADPH/ROS通路,从而抑制心肌梗死和血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞ECM重构和心肌纤维化[64]。丹参酮-I可以促进Nrf2从细胞质进入细胞核,进而激活下游通路,当Nrf2基因沉默表达后,显示丹参酮-I失去对放射性膀胱损伤体外模型的保护性作用[65]。丹参酮-I通过介导Nrf2/ARE信号通路表达来提高膀胱组织内抗氧化应激损伤的能力,有效减缓放射性膀胱伤慢性期纤维化。

2.3 Nrf2激活剂 相关研究Nrf2转录因子的药理学激活似乎是抑制各种组织和器官中与大量ROS产生相关的氧化应激的有效策略。多种化合物被报道在不同的细胞类型中激活Nrf2蛋白并刺激其靶基因的激活剂包括合成化合物以及常见于植物或食品中的天然分子。从中药白术中提取的倍半萜单体白术烯内酯Ⅱ(ATR Ⅱ)通过激活Nrf2,上调下游靶基因HO-1和NQO1的表达,达到预防放射诱导损伤的作用[66]。白藜芦醇是重要的抗氧化剂,可通过诱导激活Nrf2介导ARE下游抗氧化酶基因的表达,增强抗氧化酶SOD和GST的活性,对抗紫外辐射所致的氧化应激有一定的保护作用[67]。萝卜硫素通过激活Nrf2介导的氧化应激和NLRP3/NF-κB炎性通路来保护胰腺腺泡细胞损伤[68]。表儿茶素没食子酸酯(EGCG)是儿茶酚的主要组成成分,EGCG通过增加Nrf2的核入位,诱导Ⅱ相解毒酶抗氧化基因表达,增强抗氧化、炎性和抗纤维化活性,达到有效缓解放射诱导氧化应激损伤的作用[58]。白花紫露草的主要活性成分bracteanolide A可通过激活Nrf2及其下游保护蛋白酶NQO1和HO-1的表达来抑制细胞内ROS的产生,减轻氧化应激,降低炎性细胞因子的水平[69]。有文献报道,丙戊酸钠可以通过激活Nrf2/HO-1通路来减轻放射所致的脑损伤[70]。香叶醇是一种天然精油,在肝脏缺血再灌注前口服香叶醇的保肝作用是诱导Nrf2的激活以及HO-1表达的上调,抑制炎性介质和细胞凋亡,改善抗氧化防御系统并减少氧化应激[71]。除了这些化合物外,还有很多化合物都能影响Nrf2的转录和表达。总之,关于Nrf2的激活剂已成为预防和保护放射性损伤的研究重点,在医学临床治疗中有着重要的应用价值。

Nrf2作为氧化应激防御最有效的效应物,对氧化还原基因的反式激活提供了抗氧化损伤的宿主防御机制,有助于增强细胞和组织的抗炎活性。