胆管闭锁患儿肝脏组织中跨膜转运蛋白39A表达观察

孔萌，白月霞，刘红真，刘威，刘传阳，张士松

1 山东大学附属儿童医院（济南市儿童医院）普外科，济南 250022；2 山东大学附属儿童医院（济南市儿童医院）病理科

胆管闭锁是一种严重的小儿胆管疾病，病死率较高［1-2］。尽管Kasai 手术能够解除部分患儿胆管梗阻，但肝纤维化持续性进展是胆管闭锁预后较差的重要因素［3］。目前关于胆管闭锁发病的具体原因尚不明确。有研究发现该病可能与遗传易感性、围产期病毒感染、炎症因素、免疫损伤和血管源性等因素有关［4］。跨膜转运蛋白39A（TMEM39A）是跨膜转运蛋白家族中的一员［5］。遗传学研究证实，TMEM39A在原发性胆汁性胆管炎（PBC）进展中起着重要作用，而PBC 是一种以非化脓性胆管炎、肝纤维化及胆汁淤积性肝硬化为特征的慢性自身免疫性肝病［6］。最新研究发现，TMEM39A有调节内质网应激反应和促进前胶原蛋白的产生及分泌等功能，而胶原蛋白产生过多会加速器官衰老和组织纤维化［7］。关于TMEM39A是否参与胆管闭锁发生发展及TMEM39A在肝脏中的表达情况，目前尚不明确。为此，本研究观察了胆管闭锁患儿肝脏组织中TMEM39A 的表达变化，初步探讨TMEM39A与胆管闭锁发病的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年1 月—2022 年8 月山东大学附属儿童医院收治的胆管闭锁患儿30 例纳入病例组，男15 例、女15 例，年龄28 ～ 90（45 ± 5）d，患儿均于术前诊断为胆管系统疾病，术中经胆管造影和术后病理确诊为胆管闭锁，排除合并其他胆管闭锁相关疾病者。由于受医学伦理限制，无法获取患儿正常肝脏作为对照，本研究在参考国内外文献［8-9］基础上选取同期收治的先天性胆总管囊肿患儿30 例为对照组，男12 例、女18 例，年龄2 ～ 96（42 ± 1）个月，患儿经手术确诊为先天性胆总管囊肿且术后病理肝脏未见纤维化，患儿肝功能、胆红素指标均正常，排除合并其他肝功能、胆红素异常的胆管系统疾病者。术中用组织剪分别剪取两组患儿肝右叶前缘组织（约黄豆大小），电凝肝脏创面充分止血。部分肝组织置于4%甲醛溶液固定、脱水、石蜡包埋、4 μm 厚连续切片，60 ℃烘烤90 min，用于免疫组化染色。其余肝组织储存于液氮罐中，用于Western blotting 和RT-qPCR 检测。本研究经山东大学附属儿童医院伦理委员会批准（审批编号SDFE-IRB/P-2022023）。入组患儿家长对本研究知情同意并签署知情同意书。

1.2 肝脏组织中TMEM39A蛋白检测

1.2.1 免疫组化法 取两组4 μm厚石蜡切片脱蜡至水，放入柠檬酸钠溶液高压抗原修复3 min，冷却至室温后用3% H2O237 ℃孵育10 min灭活内源性过氧化物酶活性，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗3 次，羊血清封闭抗原30 min；滴加一抗TMEM39A（1∶200 稀释），4 ℃冰箱过夜，次日取出切片后PBS 冲洗3 次；滴加二抗（1∶1 000 稀释），37 ℃孵育30 min，PBS 冲洗3 次；二氨基联苯胺显色，苏木精复染后脱水、透明、封片；显微镜下观察切片，采用Image Pro Plus6.0 进行半定量分析，计算光密度值，取5 个视野的平均值表示蛋白相对表达量。

1.2.2 Western blotting 法 从液氮中取出肝脏组织后，用RIPA 裂解液进行裂解并提取总蛋白，用二喹啉甲酸法测蛋白浓度；稀释并定量蛋白样品，取20 μL 进行电泳并恒流转到聚偏氟乙烯膜上；加多克隆抗体TMEM39A 一抗（1∶1 000 稀释）和内参β肌动蛋白抗体（1∶10 000稀释），4 ℃过夜，次日TBST清洗；加二抗（1∶10 000 稀释）室温孵育1 h，TBST 洗膜，显色剂显影；采用化学发光法对条带灰度值进行扫描，目的蛋白相对表达量=目的蛋白条带灰度值/内参蛋白条带灰度值。

1.3 肝脏组织中TMEM39A mRNA 检测 采用TRIzol 法提取肝脏组织总RNA，分光光度计测定浓度及纯度。总RNA 质量合格后，依据逆转录试剂盒操作说明对RNA 进行逆转录获得cDNA。根据NCBI Genbank 中提供的基因全长序列，用Primer-BLAST 软件设计目的基因序列。TMEM39A 上游引物序列为5'-GCAGCATACGGGGCATAAGA-3'，下游引物序列为5'-TTACCCACCTTAGACCACCCA-3'，目的片段大小为354 bp；内参GAPDH 上游引物序列为5'-GGTGGTCTCCTCTGACTTCAACA-3'，下游引物序列为5'-TTTGCTGTAGCCAAATTCGTTGT-3'，目的片段大小为127 bp。引物由北京擎科生物公司合成。按照SYBR Green 10 μL 体系置于荧光定量PCR 仪中 进 行PCR 反 应。PCR 反 应 条 件：94 ℃ 30 s，94 ℃ 5 s，55 ℃ 30 s，共40 个循环。以2-ΔΔCt表示目的基因相对表达量。

1.4 统计学方法 采用SPSS23.0 软件进行统计分析。符合正态分布的计量资料以±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组肝脏组织中TMEM39A 蛋白表达比较 免疫组化检测结果显示，TMEM39A 蛋白主要定位于肝细胞的胞质，胞核不着色；病例组TMEM39A 蛋白在汇管区周围肝细胞胞质内表达强阳性，相对表达量为0.695 ± 0.137；对照组TMEM39A 蛋白在肝细胞胞质表达弱阳性，相对表达量为0.375 ± 0.096；病例组肝脏组织中TMEM39A 蛋白相对表达量高于对照组（t=10.426，P＜0.05）。见OSID码图1。Western blotting 检测结果显示，病例组、对照组肝脏组织中TMEM39A 蛋白相对表达量分别为0.624 ± 0.082、0.352 ± 0.082，病例组高于对照组（t=12.188，P＜0.05）。见OSID码图2。

2.2 两组肝脏组织中TMEM39A mRNA 表达比较 病例组、对照组肝脏组织中TMEM39A mRNA 相对表达量分别为5.724 ± 1.490、2.338 ± 0.984，病例组高于对照组（t=10.382，P＜0.05）。

3 讨论

胆管闭锁的具体病因尚未完全阐明。多数学者认为该病可能与围生期病毒感染（如巨细胞病毒感染）、遗传易感性、炎症反应、血管源性因素及免疫损伤有关［10］。肝脏持续进行性纤维化是胆管闭锁的典型特征［11］。在肝纤维化过程中，肝星状细胞是主要的肌成纤维细胞祖细胞，因此是成纤维反应的关键效应细胞［12］。在正常肝脏中，肝星状细胞是静止的、不增殖的；当肝脏发生损伤时，肝星状细胞被激活，进而转化成肌成纤维细胞。在此过程中，肝星状细胞的增殖能力、趋化能力、成纤维能力增强，凋亡能力及基质降解能力减弱，同时表达高水平的α 平滑肌肌动蛋白，产生大量细胞外基质蛋白成分（包括Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ型胶原蛋白、纤维连接蛋白等）和促炎介质［13］。胶原蛋白是结缔组织的主要分子成分，是动物中表达最丰富的蛋白质。胶原蛋白的产生和分泌失调会导致多种疾病，包括自身免疫性疾病、脆性骨病、器官衰老和组织纤维化等。胶原蛋白的生物合成是一个复杂的过程，包括前胶原基因转录和蛋白质翻译、翻译后修饰、在内质网内组装成前胶原三聚体、内质网囊泡分泌、细胞外肽裂解和交联合成胶原纤维［14-15］。尽管学者们一直致力于研究胆管闭锁病因和肝纤维化治疗方法，但目前胆管闭锁尚无特效治疗策略和治疗靶点。因此需要进一步探索胆管闭锁发病的详细机制，包括在发病过程中发挥关键作用的基因和蛋白。

TMEM 是一种存在于生物体中的完整膜蛋白，是细胞膜、内质网、高尔基体和线粒体的组成部分，许多TMEMs 可作为允许特定元素通过生物膜运输的通道［16］。TMEM39 蛋白家族包括人TMEM39A 和线虫TMEM39。TMEM39A 是一种内质网定位的跨膜蛋白，其蛋白序列由488个氨基酸和8个跨膜螺旋片段组成，通过调节炎症、干扰素信号通路、自身抗体及线粒体的自噬作用来发挥作用［17］。遗传学研究已经证实，TMEM39A 主要与PBC、桥本甲状腺炎等自身免疫性疾病的发病有关［18］。PBC 是一种T 细胞介导的小叶内胆管上皮细胞损伤的慢性自身免疫性肝病，肉芽肿破坏和胆管细胞坏死导致炎症浸润，最终导致胆汁淤积和肝纤维化［19］。小鼠模型研究发现，PBC 免疫耐受的丢失可能与IL-9/IL-9R 轴的作用有关。IL-9R 是TMEM39A 的一个重要作用位点，TMEM39A 可能会影响IL-9/IL-9R 轴的作用，使PBC患者失去免疫耐受［20］。流行病学调查结果显示，桥本甲状腺炎的发病可能TMEM39A 有关［21］。上述研究结果提示，TMEM39A 很可能参与了组织慢性纤维化的发生。

本研究发现，TMEM39A 主要表达于汇管区周围肝细胞胞质内，且TMEM39A mRNA 和蛋白在胆管闭锁肝脏组织中的表达量高于正常肝脏组织，提示胆管闭锁的发生可能与肝脏组织中TMEM39A 的高表达密切相关。ZHANG 等［22］研究发现，TMEM39A 可调节内质网应激反应和前胶原蛋白的产生、分泌和运输，而前胶原蛋白堆积可间接促进组织纤维化。这项研究结果与本研究相一致，提示TMEM39A 高表达于肝脏组织中，并可能与胆管闭锁和肝组织进行性纤维化密切相关。我们前期研究通过生物信息学分析预测出SPP1 和ANKRD1 与胆管闭锁的发生有关，两者有望作为胆管闭锁的早期诊断标志物［23］。我们的另一项研究发现，LECT2 在胆管闭锁患儿肝脏中的表达明显高于正常肝脏，LECT2 在人肝星状细胞系中过表达能促进纤维化的发生，推测LECT2 可能与胆管闭锁的发病有关，并且能够促进胆管闭锁肝纤维化的进展［24］。目前TMEM39A 蛋白促进胆管闭锁肝纤维化的详细作用机制尚不明确，结合以上结果，我们推测TMEM39A 可能是通过加强胞质结构域与囊泡外蛋白结合，促进前胶原蛋白的产生、分泌和运输，而前胶原蛋白产生过多会使细胞外基质大量堆积，从而诱发肝纤维化。当然，这还需要大量的实验研究来证实。

总之，本研究发现，胆管闭锁患儿肝脏组织中TMEM39A 蛋白及mRNA 表达升高，TMEM39A 异常表达可能与胆管闭锁的发病和肝纤维化有关，这也为我们后续通过细胞实验和动物实验深入研究TMEM39A 在胆管闭锁发病中的作用机制提供了新的思路。同时，以上研究发现也为胆管闭锁进行性肝纤维化治疗靶点的探索提供了新的方向，为延缓或终止肝纤维化的相关研究提供了参考。