谷子MAPK家族成员的鉴定及其对生物胁迫的响应分析

刘 佳 邹晓悦 马继芳 王永芳 董志平 李志勇,* 白 辉,*

谷子MAPK家族成员的鉴定及其对生物胁迫的响应分析

刘 佳1,**邹晓悦1,2,**马继芳1王永芳1董志平1李志勇1,*白 辉1,*

1河北省农林科学院谷子研究所 / 农业农村部特色杂粮遗传改良与利用重点实验室(省部共建) / 河北省杂粮研究实验室, 河北石家庄 050035;2河北师范大学生命科学学院, 河北石家庄 050024

MAPK在植物的生长发育调节、生物和非生物胁迫反应、激素信号转导中具有重要作用。系统分析谷子基因家族成员全基因组分布、结构、进化及其响应不同胁迫的表达特性, 对于阐明其生物学功能具有重要意义。本研究利用谷子和水稻MAPK蛋白保守结构域及特异TXY基序的氨基酸序列在全基因组水平鉴定了谷子家族成员, 分析其蛋白质理化性质、系统进化、染色体定位、基因结构、蛋白质保守基序、启动子顺式作用元件及共线性等。利用荧光定量PCR技术, 分析了谷子在不同组织部位和谷锈菌、玉米螟病虫害生物胁迫以及不同激素处理下的表达模式。结果显示, 共鉴定到15个谷子成员, 其编码的蛋白质含有220～611个氨基酸, 相对分子量范围25.77～69.63 kD, 等电点范围5.46～9.34。系统进化分析表明,基因分为4组, A、B、C组包含TEY基序, D组包含TDY基序。基因分布在1号、3号、4号、5号、8号和9号染色体上, 含有3～11个外显子, 所有SiMPK蛋白均含有motif 1与motif 2。上游2000 bp启动子区域预测到多个与胁迫、激素和植物生长发育等相关的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明, 大部分基因具有明显的组织表达特异性; 除和外, 其余成员对谷锈菌侵染、玉米螟取食、SA和MeJA激素处理等1～3种胁迫具有明显响应。以上结果为进一步研究基因在谷子应对病虫害生物胁迫中的功能奠定了理论基础。

谷子; MAPK家族; 谷锈菌; 玉米螟; 表达分析

丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK或MPKs)级联途径是真核生物中高度保守的信号转导模块, 通过逐级磷酸化反应将不同的细胞外刺激与广泛的细胞内反应联系起来, 在多种生物过程中发挥着重要作用[1-3]。

植物中, MAPK级联反应主要由MAPK激酶激酶(MAPKKKK或MEKK)、MAPK激酶(MKK或MEK)和MAPK 3种顺序磷酸化激活的蛋白激酶组成[4]。MAPK位于MAPK级联途径末端, 是连接上游MAPKK和下游底物的枢纽, 表现出更多的复杂性和序列多样性[5]。MAPK在激酶结构域VII和VIII之间的激活环中具有TEY或TDY磷酸化基序, 它们为MAPK的激活提供蛋白质结合位点[6-7]。植物MAPK可分为A、B、C和D 4个组, 其中A、B和C组成员在其磷酸化位点具有TEY基序, 而D组成员具有TDY基序[4,6]。目前已经在多种植物中对MAPK基因家族进行了系统鉴定与特征分析, 在模式植物拟南芥()[8]、水稻()[9]和二穗短柄草()[10]、玉米()[11]、大麦()[12]和小麦()[13]等禾本科作物中分别鉴定出20、17、16、19、20和54个MAPK基因。

MAPK在植物的生长发育、生物和非生物胁迫反应、激素信号转导中都发挥着重要作用[1,3-4,14-16]。在调节植物生长发育方面,激酶参与调节了拟南芥花药、花序和胚胎的发育[17]。缺失的水稻植株具有矮化、小籽粒、直立和深绿色叶片等多效性的突变表型[18]。在植物应对生物胁迫方面, 3个基因参与了水稻对稻瘟病的抗性反应, 其中[19]是正调控因子, 沉默该基因造成转基因植株对稻瘟病的感病程度增强;与是负调控因子,的抑制表达导致和基因在dsRNAi转基因水稻中组成性表达, 并显著增强了对稻瘟病的抗性[20],基因敲除突变体不仅导致基因的组成性表达, 还导致活性氧积累增加、水杨酸(salicylic acid, SA)和茉莉酸(jasmonic acid, JA)通路相关基因显著上调表达造成SA和JA等激素积累, 显著增强了对稻瘟病的抗性, 说明通过SA和JA信号途径负调控稻瘟病抗性[21]。此外, 也有研究表明参与了水稻对二化螟()的抗性。通过调节JA信号通路和促进胰蛋白酶抑制剂的积累来触发水稻对二化螟的抗性[22],通过调节JA、乙烯(ethylene, ET)和SA信号通路来参与水稻对二化螟的抗性[23]。

谷子()是我国传统的粮饲兼用作物, 具有抗旱耐瘠、营养丰富均衡、保健功能突出等特点, 是民众膳食结构改善和种植业结构调整的主体作物[24-25], 近年来, 在绿色可持续生态发展、质量发展和营养导向型农业发展需求下谷子产业发展进入了快车道[26]。但是谷子病虫害仍然是谷子产业规模发展的限制因素之一。由粟单孢锈菌(Yoshino)侵染引起的谷子锈病属于暴发流行性病害, 一旦发生会给谷子生产带来巨大的经济损失[27]。亚洲玉米螟()以幼虫咬食心叶, 并钻蛀谷子茎秆和穗柄造成枯心或白穗, 严重发生时可引起植株倒折, 造成减产[28]。因此,揭示生物胁迫的抗性机制和识别抗性相关的基因家族至关重要。基于此, 本研究对谷子中MAPK基因家族进行了全面的研究, 包括系统发育、染色体定位、基因结构、蛋白质保守基序、顺式作用元件、物种内和物种间的进化等生物信息学分析, 以及利用qRT PCR技术研究了谷子在不同组织部位、谷锈菌、玉米螟等病虫害生物胁迫下以及不同激素处理下的表达模式, 旨在为研究谷子的功能和表达调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 试验材料

谷子锈菌为强毒性小种A57的单孢菌系93-5, 菌种的扩繁与保存参照梁克恭等[29]方法。供试谷子材料为‘十里香’和‘豫谷1号’, 其中十里香对谷锈菌单孢菌系93-5表现抗病反应, 豫谷1号对93-5表现感病反应。谷子在光照培养箱中进行盆栽试验(塑料盆直径12 cm), 培养箱温度22℃, 光周期12 h/12 h。亚洲玉米螟原始种群采自石家庄栾城郄马试验站, 在光照培养箱中人工继代培养, 培养箱温度27℃、相对湿度70%～80%、光周期16 h/8 h。

1.2 不同条件下的取材

(1) 谷子发育过程中的不同组织部位取材: 选取豫谷1号幼苗期地上部分、地下部分, 孕穗期的根、茎、叶、穗6个部位进行样品采集; (2) 谷锈菌接种处理和激素处理均按照白辉等[30]方法, 谷锈菌处理的叶片取材时间是接种后0、8、12、16和24 h, 激素处理的叶片取材时间是0、8、12、16、24和48 h; (3) 玉米螟为害诱导处理与取材: 选取五叶期的健康幼苗, 用小毛笔轻轻地在谷子叶片上接种20头预先饥饿处理的2龄幼虫, 待幼虫取食0、8、12、24和48 h后收集叶片。上述收集的样品均为3个生物学重复, 液氮速冻后,-80℃冰箱保存备用。

1.3 谷子MAPK家族成员的鉴定

从水稻数据库TIGR (http://rice.uga.edu/)下载已报道的17条水稻MAPK蛋白序列[9], 利用Muscle及HMM3.0建立MAPK的hmm模型。通过该模型及HMM3.0软件对谷子蛋白质组序列(https://phy­tozome-next.jgi.doe.gov/info/Sitalica_v2_2)进行搜索, 阈值<0.01, 获取可能的MAPK候选基因。对候选基因进行TEY或TDY基序筛选以确保所有成员具有该结构, 之后通过NCBI保守结构域数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd)核实所有候选基因都具有蛋白激酶结构域, 最后对候选基因进行冗余检查和命名。利用ExPASy (https://web.expasy.org/ protparam/)、CELLO v.2.5 (http://cello.life.nctu.edu.tw/)和SignalP (https://services.healthtech.dtu.dk/service. php?SignalP-4.1)分别进行谷子MAPK基因家族理化性质、亚细胞定位和信号肽预测。

1.4 谷子MAPK家族成员的系统进化分析

利用MEGA 7.0软件采用邻接法(Neighbor- Joining, NJ)对鉴定出的15条谷子MAPK蛋白序列和已报道的20条拟南芥MAPK蛋白序列[8]、17条水稻MAPK蛋白序列[9]构建系统发育进化树。设置参数为: Bootstrap method、1000 bootstrap replications、Partial deletion以及50% Site coverage cutoff。

1.5 谷子MAPK家族成员的染色体位置、基因结构、保守基序分析

从Phytozome下载谷子基因组结构注释文件, 使用TBtools[31]Gene Location Visualize from GTF/ GFF功能绘制谷子MAPK基因的染色体物理分布图;将谷子15条MAPK蛋白序列提交到MEME (https:// meme-suite.org/meme/tools/meme)进行Motif预测, 参数设置: 基序数目15个, 其余参数默认, 通过TBtools Gene Structure View (Advanced)功能对基因结构和保守基序绘图展示。

1.6 谷子MAPK基因家族共线性分析

从Phytozome下载谷子基因组序列文件和基因结构注释文件, 运用TBtools进行谷子全基因组序列自身比对和谷子MAPK基因家族复制分析并展示。从拟南芥数据库TAIR (http://www.arabidopsis. org/)和水稻数据库TIGR分别获取拟南芥和水稻的全基因组序列文件和基因结构注释信息文件, 将谷子全基因组序列通过TBtools分别与拟南芥、水稻全基因组序列比对, 进行谷子与拟南芥、谷子与水稻的基因共线性关系分析与展示。

1.7 启动子顺式作用元件分析

通过TBtools提取谷子MAPK家族基因起始密码子上游2000 bp的序列, 在PlantCARE网站(http:// bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/)进行启动子顺式作用元件预测分析, 利用TBtools Basic BioSequence Viewer功能进行可视化展示。

1.8 谷子总RNA提取、实时荧光定量PCR检测与分析

采用RNA Easy Fast植物组织RNA快速提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司, DP452)提取不同处理谷子样品的总RNA, 通过FastKing cDNA第1链合成试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司, KR112)反转录获得cDNA, 作为qRT-PCR的模板。选用谷子肌动蛋白基因()作为内参基因。qRT-PCR反应体系为20 μL: 10 μL TB Green Premix ExII (TaKaRa, RR820A)、0.8 μL上/下游引物、2 μL cDNA模板和6.4 μL灭菌双蒸水。反应程序为95℃预变性30 s; 95℃变性5 s, 60℃退火加延伸30 s, 共40个循环收集荧光信号[30]。每个反应3次重复, 采用2-ΔΔCt法计算谷子MAPK基因在不同样品中的相对表达量, 与对照相比, 将差异倍数≥1.5作为差异表达的筛选标准, 使用SPSS26.0进行显著性分析。用于qRT-PCR的引物信息见表1。

表1 引物序列表

2 结果与分析

2.1 谷子MAPK家族成员的鉴定与分析

在谷子基因组中共鉴定到15个MAPK基因, 基于谷子中MAPK蛋白序列与水稻MAPK蛋白序列的同源关系, 将谷子中MAPK基因依次命名为、、、、、、、、、、、、、和。所有的谷子MAPK都包含TEY或TDY磷酸化位点。15个编码蛋白质长度在220～611 aa之间, 分子量在25.77～69.63 kD之间, 等电点介于5.46～9.34之间。亚细胞定位预测显示7个SiMPK蛋白质位于细胞质, 其余8个蛋白质位于细胞核中。所有SiMPK蛋白质都不具有信号肽(表2)。

2.2 谷子MAPK家族成员的系统进化分析

为研究MAPK蛋白之间的进化关系, 利用谷子15个、拟南芥20个、水稻17个的氨基酸序列构建了系统进化树(图1)。结果表明, 15个被分为A、B、C和D组。其中A、B和C组的具有TEY基序, D组的具有TDY基序。A组包括和, B组仅有, C组包括和, 而剩余10个全部分配到D组(图1), 可见, D组数量最多, B组数量最少。而且其他2个物种在D组中的MAPK成员数量也最多, 因此D组基因的扩展为谷子的基因组进化分析提供了参考。

2.3 谷子MAPK家族成员的染色体位置分析

对谷子染色体上MAPK基因位置分析(图2)发现, 15个基因不均匀的分布于6条染色体上, 3号染色体分布4个基因, 4号和5号染色体均分布3个基因, 1号和9号染色体均分布2个基因, 8号染色体仅分布1个基因。此外, 没有出现串联重复的基因, 物理距离最小的和基因之间距离为349 kb。而且, 属于系统进化树中同一组的基因分布在不同的染色体上, 或者是部分基因分散在同一条染色体上的不同位置。如D组的10个分布在1号、3号、4号和5号染色体上, 其中、、和分散在3号染色体的不同位置。

表2 谷子SiMPK家族成员特征

图1 谷子、水稻和拟南芥中MAPK基因家族系统发育进化树

Si: 谷子; Os: 水稻; At: 拟南芥。

Si:: Os:: At:.

图2 SiMPK基因在谷子染色体上的分布

2.4 谷子MAPK家族成员基因结构、保守基序及结构域分析

对15个基因的外显子-内含子结构进行了分析, 如图3所示, 结合进化分析发现, A组中和分别由6个和5个外显子组成, B组包含7个外显子, 而C组的和只有3到4个外显子, D组的10个成员中, 除了含有4个外显子外, 其余9个基因存在9到11个外显子, 说明不同组中的基因具有显著不同的外显子/内含子结构, 但同一组的基因结构相似, 且外显子区段的大小和分布相近。

利用NCBI和MEME在线网站对谷子MAPK蛋白序列进行结构域和保守基序分析(图3和图4)发现,其中motif 1与motif 2存在于所有SiMPK蛋白中, motif 7包含TDY特征基序, 存在于D组成员中; motif 8包含TEY特征基序, 存在于A、B、C组成员中。在MAPK蛋白N端, A、B、C组成员包含motif 15, D组成员包含motif 8; 在C端, A、B组成员均具有一个CD结构域, 位于motif 13, C组和D组没有该结构域, C组成员包含motif 14, D组成员(除外)包含motif 10, 并且D组有一个相对较长的C末端区域, 说明同一组成员具有相似的保守基序。

2.5 谷子MAPK家族成员启动子顺式作用元件分析

起始密码子上游2000 bp的序列进行顺式作用元件分析(图5)表明, 15个启动子区域除具有CAAT框、TATA框保守元件外, 还具有15种419个与胁迫、激素和植物生长发育等相关的重要顺式作用元件。启动子序列中的1742 bp是N, 因此该基因启动子只鉴定到1个与分生组织表达相关的顺式调节元件, 而其他14个的启动子区域均鉴定到了6～11种顺式作用元件。所有14个的启动子都包含光响应元件。大多数启动子中的顺式作用元件参与了胁迫反应, 其中3个(、和)启动子含有防御和胁迫响应顺式作用元件, 3个(、和)启动子含有低温胁迫响应顺式作用元件, 10个(、、、、、、、、和)启动子包含厌氧诱导所必需的顺式调节元件, 10个(、、、、、、、、和)启动子含有与缺氧特异性诱导有关的增强子样元件, 8个(、、、、、、和)启动子含有参与干旱诱导的MYB结合位点。每个启动子都含有3～5个激素(茉莉酸甲酯、脱落酸、水杨酸、赤霉素、生长素)响应元件。此外还有3个的启动子包含参与玉米醇溶蛋白代谢调节的O2位点, 9个的启动子具有参与分生组织表达的CAT框, 2个的启动子具有参与胚乳表达所需的GCN4基序。这些结果说明了谷子基因家族在植物生长发育、胁迫应答和激素信号通路中可能具有重要作用。

Motif: 保守基序; UTR: 非翻译区; CDS: 编码区序列。

Motif: conserved base sequence; UTR: untranslated region; CDS: coding region sequence.

图4 谷子MAPK保守基序的序列Logo

图5 谷子15个SiMPK基因启动子中顺式作用元件

2.6 谷子MAPK家族成员共线性分析

通过TBtools分析谷子基因间可能的关系和潜在的基因重复(图6)发现, 谷子的染色体上存在4对片段重复, 2个配对的基因(、)位于1号和4号染色体上,配对基因位于5号染色体上,配对基因存在于1号和3号染色体上。

对谷子与拟南芥及水稻之间的MAPK分别进行共线性分析(图7)发现, 谷子与拟南芥之间的基因不存在共线性的基因组区域(未附图), 21个匹配的同源基因对位于谷子与水稻基因组之间具有共线性的基因组区域。除与外, 谷子其余基因都能在水稻中匹配到同源基因, 其中8个基因(、、、、、、和)分别与2个基因存在同源对, 5个基因(、、、、)分别与1个基因存在同源对, 表明基因和基因之间的相关性相似, 这对分析物种间的进化关系和预测基因功能具有重要意义。

2.7 谷子MAPK基因不同发育时期组织部位表达模式分析

qRT-PCR表达模式分析如图8所示, 在谷子苗期,在地上部分表达水平高于地下部分;、与地下部分表达水平高于地上部分, 其他基因在地上和地下部分的表达水平差异不显著。在孕穗期, 较其他3个组织,、、和在根中表达水平最高,、、、、和在根中表达水平最低;、在茎中表达水平最高; 每个基因在茎中的表达水平都高于叶片, 其中、、、、、和的表达量差异显著;、和在穗中的表达量显著高于其他组织。

图6 谷子MAPK基因家族共线性分析

图7 谷子与水稻MAPK基因的共线性分析

图8 SiMPK家族基因在谷子不同组织部位中的表达分析

SD: 苗期; BT: 孕穗期; shoot: 苗期地上部; root: 苗期地下部或孕穗期根。不同字母表示差异水平显著(< 0.05)。

SD: seedling stage; BT: booting stage; shoot: the aboveground part at seedling stage; root: the underground part at seedling stage or root at booting stage. The different letters mean significant difference at the 0.05 probability level.

2.8 谷子MAPK基因在谷锈菌侵染下的表达模式分析

在谷锈菌侵染谷子后转录水平表达分析结果(图9)表明, 除未检测到明显信号外, 其余14个均有表达。、和在抗病(R: 十里香-93-5)、感病(S: 豫谷1号-93-5)反应中没有发生明显的表达变化。、、、和在R、S反应中表达趋势一致, 其中前4个基因均表达上调,下调表达, 推测5个基因在谷子基础免疫反应中起作用。、和在R反应12 h显著上调表达,与在S反应全程下调表达,在S反应中表达不变;在R反应12、16 h下调表达, S反应8 h上调表达, 推测这4个基因与抗病相关。此外,的表达在S反应中下调, R反应中不变;的上调表达S反应早于R反应。

图9 谷子SiMPK基因在谷锈菌侵染的谷子叶片中的表达分析

* 代表基因在同一时间点的抗病反应与感病反应中的相对表达量在0.05概率水平差异显著。

* represents that the relative expression levels of genes in disease-resistant and disease-sensitive reactions at the same time point are significantly different at the probability level of 0.05.

2.9 谷子MAPK基因在玉米螟取食下的表达模式分析

在谷子被玉米螟取食后的qRT-PCR表达模式分析如图10所示, 除未检测到表达信号外, 其余14个SiMPK基因均有不同程度的表达。在玉米螟取食12 h内上调表达,在48 h上调表达。、、、、、、、和在48 h内下调表达, 其中和在0 h至48 h持续下调。在48 h内的表达先上调再下调, 12 h达到峰值, 是0 h表达量的1.87倍。和在48 h内的表达均无明显变化, 推测这2个基因可能不参与对虫害胁迫的响应。

2.10 谷子MAPK基因在外接SA和MeJA后的表达模式分析

qRT-PCR表达模式分析如图11所示, 除同样无信号外, 其余14个SiMPK基因在SA与MeJA处理中的表达模式较一致。、、和四个基因在SA与MeJA处理后的48 h内诱导表达, 其中的表达在MeJA处理的48 h达到峰值, 是0 h的4.34倍,在SA与MeJA处理后的8 h和12 h均明显上调表达。、和在2种激素处理后的48 h内下调表达。、的表达在SA与MeJA处理后的48 h内先下调再上调, 其中在SA处理的16 h达到峰值, 是0 h表达量的5.8倍。的表达在SA处理的16～48 h先上调再下调, 而在JA处理后期持续下调;的表达与之相反。、和在SA与JA处理后的48 h内表达均无明显变化, 推测这3个基因可能不参与谷子对SA与MeJA的响应。

图10 谷子SiMPK基因在玉米螟取食的谷子叶片中的表达分析

* 代表基因在玉米螟取食后不同时间点的叶片中的相对表达量与0 h相比在0.05概率水平差异显著。** 代表在0.01概率水平差异显著, *** 代表在0.001概率水平差异显著。

* represents that the relative expression levels of genes in the leaves at different time points after being fed byare significantly different at the probability level of 0.05 compared with 0 h. **:< 0.01; ***:< 0.001.

* 代表基因在SA/JA处理谷子叶片后不同时间点的相对表达量与0 h相比在0.05概率水平差异显著, ** 代表在0.01概率水平差异显著, *** 代表在0.001概率水平差异显著。

* represents that the relative expression levels of genes in the leaves at different time points after SA/JA treatment are significantly different at the probability level of 0.05 compared with 0 h; **:< 0.01; ***:< 0.001.

3 讨论

3.1 谷子MAPK基因家族的生物学特征

MAPK是信号级联途径的重要组成部分, 与植物的生长发育和环境胁迫响应有关。2015年Mohanta等[32]在全基因组范围内对40个物种的基因进行了鉴定, 在谷子豫谷1号参考基因组2.1版本基础上鉴定到16个SiMPK基因。本研究在谷子基因组2.2版本基础上鉴定到15个SiMPK基因, 并根据与水稻的同源序列相似性进行了命名。与之前版本相比, 本次鉴定到的基因纠正了3个基因的命名(修改为、修改为、修改为), 去掉了与重复的原和无TXY结构的原, 增加了一个与水稻同源的基因, 命名为, 该基因编码的氨基酸长度只有220 aa, 是所有基因编码蛋白质中最短的, 并且启动子序列中1742 bp的长度全部是N, 可能与谷子基因组测序质量和注释有关。

MAPK的特征是激活环区域存在保守的TEY/TDY基序。根据系统进化树、基因结构与保守基序的分析, 15个分为了A、B、C和D四组, 其中A、B和C组成员具有TEY基序, 位于motif 8; D组成员具有TDY基序, 位于motif 7, 这与其他植物如拟南芥、大麦、高粱、二穗短柄草、鹰嘴豆等分析结果一致[10,12,14,33-34]。有趣的是, motif 8不仅存在于A、B、C组的MAPK激活环区域, 还存在于D组成员的N端, 保守基序是TEY、TDY和SEY, 这与文献报道也是一致的[32]。此外, A、B组的3个基因的C端区域包含一个CD结构域, 位于motif 13, 保守基序为DIXD/EEPXC, 与二穗短柄草、鹰嘴豆等文献报道的DxxDE(P)xC基序略有不同, 该结构域作为MAPK级联途径中MAPKK的结合位点发挥作用[14,33]。对外显子-内含子的数量和顺序的分析表明, 同一组的外显子和内含子的数量和排列顺序相同或相似, D组的外显子和内含子的数量多于A、B、C组, 这与其他物种中相关分析结果一致, 进一步说明了MAPK基因家族的保守性, 而不同的基因结构可能是由于进化过程中的基因突变造成[35]。

在植物基因组进化过程中, 单个基因、染色体片段甚至整个基因组的复制是基因组形成和进化的主要力量[36]。谷子的染色体上共存在4对片段重复,配对基因位于染色体5上, 是同一染色体内的非串联重复的复制传播, 其他配对基因都位于不同染色体上, 这表明在谷子基因组进化过程中, 复制事件和染色体片段的易位可能在这些基因家族的扩展中发挥重要作用[36-37]。通过对谷子与水稻和拟南芥之间的同源性分析发现,谷子中87%的基因与水稻基因组的同源基因具有共线性, 而与拟南芥的同源基因不具有共线性, 并且谷子中连锁的基因在水稻上的同源基因也以相同的方向连锁排列, 如//和//。这种情况被解释为随机易位和插入事件造成, 或者认为谷子或水稻在进化过程中接受了祖先物种提供的基因组区域[10]。

3.2 谷子MAPK基因家族成员的时空表达特征比较

在本研究中,呈现出发育时期特异性的表达模式, 如和的根部在孕穗期表达量较苗期显著下降;和的叶片在孕穗期表达量较苗期显著下降, 而、、和的叶片在孕穗期表达量较苗期显著增加;的表达量在苗期地下部高于地上部, 而孕穗期相反, 说明上述基因参与了谷子器官发育过程的调控。在谷子“小米”组织部位的转录组测序结果[38]中,、和的叶片表达量在生长3周的苗期显著高于孕穗期, 与我们的试验结果一致。此外, 在普通小麦中,和分别只在根和花中表达[39]。苦荞中,在叶和花中特异性表达,和在茎中高表达[35]。也呈现出组织特异性表达模式, 如孕穗期的、、和在根中表达水平最高,和在茎中表达水平最高,、和在穗中的表达量最高, 与谷子“小米”[38]中和在抽穗期和授粉期的穗部高表达结果是一致的,基因在不同组织中的高度表达表明它们可能在谷子器官发育中起重要作用。

3.3 谷子MAPK基因家族成员在生物胁迫与激素处理下的表达特征比较

激素SA和JA作为重要的信号分子参与植物的生物胁迫反应, 它们之间既有拮抗, 也存在协作。JA处理的水稻可诱导的表达, 过表达增强了水稻对二化螟的抗性[23]。本研究中,在谷子中的同源基因的表达在R、SA和MeJA反应中均表现上调(JA诱导程度明显高于SA), 而S反应中不变, 而在玉米螟取食24～48 h表现下调;的启动子同时具有防御和JA 2种响应元件, 因此推测与相似, 通过JA信号途径正调控谷子对谷锈菌的抗性, 可能在谷子响应玉米螟取食胁迫中起负调控作用。通过介导JA信号通路触发水稻对二化螟的抗性[22],可被SA、JA和细菌病原菌诱导, 过表达增强了水稻对白叶枯病菌及条斑病菌的抗病性[40]。本研究中,的同源基因和的同源基因在R反应中上调表达, 在S、SA、MeJA反应及玉米螟取食后下调表达,的启动子具有SA和JA响应元件,的启动子具有JA和防御响应元件, 推测这2个基因正调控谷子对谷锈病的抗性, 通过SA或JA信号途径负调控谷子对玉米螟取食胁迫的响应。抑制表达能够增加棉花对尖孢镰刀菌的耐受性[41], 其在谷子中的同源基因具有相似的表达模式在R反应中下调表达, S、SA与JA反应中上调表达且在玉米螟取食的前12 h表达量逐渐升高, 推测负调控谷子对锈病的抗性, 通过调控SA、JA信号途径正调控谷子对玉米螟取食胁迫的响应。由此可见,与SA、JA信号分子在谷子中的相互作用机制以及在谷子应对生物胁迫反应中的作用仍需进一步研究。

4 结论

本研究鉴定出15个谷子MAPK家族成员, 分属4个组, A、B、C组具有TEY基序, D组具有TDY基序。基因表达分析表明大部分家族成员具有明显的组织特异性; 除和外, 其余13个成员在谷锈菌侵染、玉米螟取食和SA、MeJA激素处理等1～3种胁迫中具有不同的应答模式。

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Genome-wide identification and characterization of MAPK genes and their response to biotic stresses in foxtail millet

LIU Jia1.**, ZOU Xiao-Yue1,2,**, MA Ji-Fang1, WANG Yong-Fang1, DONG Zhi-Ping1, LI Zhi-Yong1,*, and BAI Hui1,*

1Institute of Millet Crops, Hebei Academy of Agriculture and Forestry Sciences / Key Laboratory of Genetic Improvement and Utilization for Featured Coarse Cereals (Co-construction by Ministry and Province), Ministry of Agriculture and Rural Affairs / Key Laboratory of Minor Cereal Crops of Hebei Province, Shijiazhuang 050035, Hebei, China;2College of Life Sciences, Hebei Normal University, Shijiazhuang 050024, Hebei, China

MAPK plays an important role in plant growth and development regulation, biotic and abiotic stress responses, and hormone signal transduction. In order to elucidate the biological function of thegenes in foxtail millet, we identified thefamily members in the genome and analyzed the distribution, structure, evolution, and its expression characteristics in response to different stresses. In this study, thegene family members were identified in the genome-wide level using the amino acid sequences of conserved domains and specific TXY motifs of MAPK proteins between foxtail millet and rice. The protein physicochemical property, phylogenetic evolution, chromosome distribution, gene structure, protein conserved motif, promoter-acting regulatory elements, and collinearity were analyzed. The relative expression patterns ofgenes in the different tissue, under the biotic stresses ofYoshino andand with different hormone treatments were analyzed by qRT-PCR. The results showed that a total of 15genes were identified, and the encoded proteins contained 220–611 amino acids, the relative molecular weight ranged from 25.77 kD to 69.63 kD, and the isoelectric point ranged from 5.46 to 9.34. Phylogenetic analysis showed thatgenes were divided into four groups. Group A, B, and C contained TEY motifs, and group D contained TDY motifs.genes were distributed on chromosomes 1, 3, 4, 5, 8, and 9, and contained 3–11 exons. All SiMPK proteins contained motif 1 and motif 2. A number of cis-acting elements related to stress, hormones and plant growth and development were predicted in the promoter regions of thegenes. Most genes had obvious tissue expression specificity. Except forand, the other members had obvious responses to 1 to 3 kinds of stresses, such asYoshino infection,feeding, and SA and MeJA treatments. The results laid a theoretical foundation for further research on the function ofgenes in the biotic stresses of disease and pest in foxtail millet.

foxtail millet (); MAPK gene family;Yoshino;; relative expression analysis

10.3724/SP.J.1006.2023.24113

本研究由国家重点研发计划项目(2018YFD1000703, 2018YFD1000700), 国家自然科学基金项目(31872880), 河北省农林科学院基本科研业务费包干制项目(HBNKY-BGZ-02), 财政部和农业农村部国家现代农业产业技术体系建设专项(CARS-06-14.5-A25)和河北省重点研发计划项目(21326338D)资助。

This study was supported by the National Key Research & Development Program of China (2018YFD1000703, 2018YFD1000700), the Natural Science Foundation of China (31872880), HAAFS Basic Science and Technology Contract Project (HBNKY-BGZ-02), the China Agriculture Research System of MOF and MARA (CARS-06-14.5-A25), and the Hebei Key Research & Development Program (21326338D).

李志勇, E-mail: lizhiyongds@126.com; 白辉, E-mail: baihui_mbb@126.com

**同等贡献(Contributed equally to this work)

刘佳, E-mail: 15031210252@126.com; 邹晓悦, E-mail: z_xiaoyue@126.com

2022-05-05;

2022-07-21;

2022-08-09.

URL: https://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1809.S.20220809.1006.003.html

This is an open access article under the CC BY-NC-ND license (http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/).