植物病原菌Nep1-Like蛋白研究进展

向 江，程建徽，魏灵珠，吴 江

(浙江省农业科学院 园艺研究所，浙江 杭州 310021)

世界上所有农作物几乎都受到植物病原菌的为害，导致减产甚至绝收，给生产者造成巨大的经济损失。病原菌在侵染植物时，会分泌一系列效应因子至寄主体内来调节寄主植物的防御反应从而完成定殖[1-2]。根据分泌蛋白的作用位点，可以将其分为质外体效应因子(apoplastic effectors)和胞质效应因子(cytoplasmic effectors)两种类型。质外体效应因子被分泌到植物细胞间隙，作用于胞外靶标和膜表面受体；胞质效应因子则通过特殊的结构运输到植物细胞内部来起作用[2]。质外体效应因子在病原菌感染寄主过程中发挥着至关重要的作用，目前已经被发现并研究的质外体类的效应因子主要包括：水解酶类、酶抑制剂、富含半胱氨酸的短肽(SCRs)、细胞壁降解酶、抑制寄主免疫反应的蛋白和NLPs(Nep1-like proteins)等[3]。NLPs是一类重要的质外体蛋白，最开始是从古柯枯萎病菌(Fusariumoxysporumf. sp.erythroxyli)培养液中纯化得到的24 ku的分泌蛋白，在古柯(Erythroxylumcoca)上可引起细胞死亡和加速乙烯的释放，因此命名为necrosis and ethylene-inducing proteins(NEP1)蛋白[4]。随后发现许多植物病原细菌、卵菌和真菌中均存在这类蛋白[5]。目前没有发现与NLP蛋白具有同源性的蛋白或功能域相似的蛋白，因此NLP蛋白被视为一类新型的致病蛋白。该蛋白家族成员在不同生物间的数量有很大差别，并且功能也存在差异性和多样性[6]。近年来，关于NLP蛋白在病原菌侵染植物过程中发挥致病功能的研究已十分深入。已经报道的NLP蛋白主要表现出两个功能，一是作为细胞毒素诱导植物组织坏死和乙烯释放，二是激发植物的防御反应[7]。然而，仍有许多NLP蛋白功能尚未明确。本文通过总结植物病原菌的NLP蛋白结构及其功能的研究进展，以期为病原菌对植物的致病机理及病原菌绿色防控等研究提供理论参考。

1 NLP蛋白结构特征与分类

虽然该类基因在生物体中广泛存在，但是不同生物所含此类基因数量差异悬殊。细菌和真菌基因组中只有2～4个NLP基因，然而在卵菌基因组中以基因家族形式存在，多达几十个[8]。NLP蛋白属于外泌蛋白，因此在N端有一段信号肽(signal peptide)序列，能够在蛋白质被病原菌释放到寄主的过程中发挥引导作用。若将信号肽去掉，NLP蛋白将丧失引发植物细胞死亡的功能[7，9]。在绝大多数NLP蛋白序列的中间区域存在“GHRHDWE”基序，对于诱导植物组织坏死活性至关重要，称为七肽基序。研究表明，该基序可能与Ca2+结合，从而影响寄主细胞膜的稳定性。若将植物细胞外的Ca2+清除，NLP蛋白对细胞膜的溶解作用受到抑制[10-11]。

NLP蛋白的N端存在2～6个半胱氨酸残基，通过对众多病原菌(包括细菌、真菌和卵菌)中的NLP序列进行比对分析发现，可以根据半胱氨酸的数量将NLP蛋白分成3种类型。含有2个半胱氨酸残基的为类型Ⅰ，含有4个半胱氨酸残基的为类型Ⅱ，含有6个半胱氨酸残基的为类型Ⅲ[12-14]。类型Ⅰ的NLP蛋白是目前发现数量最多的一类，在细菌、真菌和卵菌中均存在，并且卵菌中含有的数量最多，细菌中含有的数量最少，类型Ⅱ的NLP蛋白最初只在细菌和真菌中有发现[12]。然而，随着转录组和基因组学的飞速发展，有研究者在Pilasporangiumapinafurcum、钟器腐霉菌(Phytopythiumvexans)和寡雄腐霉菌(Pythiumoligandrum)3个卵菌中也鉴定出了类型Ⅱ的NLP蛋白，表明类型Ⅱ的NLP蛋白同样在细菌、真菌和卵菌中均存在[14-15]。类型Ⅲ的NLP蛋白仅在子囊真菌中存在[16]。类型Ⅰ和类型Ⅱ NLP蛋白N端的半胱氨酸残基能够分别形成1个和2个二硫键，对于蛋白活性至关重要[17]。类型Ⅲ NLP蛋白含有6个半胱氨酸残基，可能形成3个二硫键[16]。若将形成二硫键的2个半胱氨酸残基中的任意一个替换掉，都会导致NLP蛋白失去诱导细胞坏死的活性。有研究表明，二硫键可以通过保护蛋白质在质外体中免受蛋白水解酶攻击，以稳定蛋白质天然构象和稳定性。部分可溶性分泌蛋白的功能受到一个或多个二硫键的分裂控制[18-19]。

2 NLP蛋白在病原菌侵染寄主时的表达

不同NLP蛋白基因在侵染寄主的过程中表达模式是有差异的。具有细胞毒性的NLP蛋白能够引起植物细胞死亡，这对于依赖植物死亡细胞生存的死体营养型病原菌是非常有利的。同样，对于半活体营养寄生型病原菌的死体营养阶段也非常重要。因此，具有毒性的NLP蛋白在病原菌的死体营养阶段表达，或是在活体营养阶段向死体营养阶段转换的时期表达，促进病原菌在寄主中定殖。例如，半活体营养寄生型病原卵菌大豆疫霉菌(Phytophthorasojae)的PsojNIP基因在接种2 d后才开始表达，刚好是活体营养到死体营养阶段的转换期[9]。辣椒疫霉菌(Phytophthoracapsici)NLP1基因和致病疫霉菌(Phytophthorainfestans)NPP1.1基因分别在接种后5 d和4 d开始大量表达，同样是处在活体营养到死体营养阶段转换期[20-21]。将绿色荧光蛋白(GFP)作为报告基因，连接到瓜类炭疽菌(Colletotrichumorbiculare)的NLP1基因启动子下游，在活体营养阶段晚期和死体营养阶段能检测到绿色荧光，而在侵染早期和活体营养阶段早期则无荧光，表明NLP1基因也是在营养型转换阶段表达[22]。若人为干预，将其在病原菌中持续表达，不仅丧失了侵染黄瓜的能力，反而会激发寄主的免疫反应，表明改变NLP基因表达模式将会影响病原菌致病性[23]。

通常情况下，没有细胞毒性的NLP蛋白在侵染早期表达。拟南芥霜霉菌(Hyaloperonosporaarabidopsidis)中能检测到表达的8个无细胞毒性NLP基因，在接种6 h都已经表达，并且有4个(HaNLP1、HaNLP3、HaNLP4和HaNLP8)在尚未侵染寄主的分生孢子时期就已经表达[24]。葡萄霜霉菌(Plasmoparaviticola)PvNLP1、PvNLP2和PvNLP3蛋白均没有毒性，在侵染葡萄3 h就已经表达[25]。辣椒疫霉菌(P.capsici)中的无细胞毒性NLP蛋白表达模式也存在类似情况，大多数在侵染早期表达[26]。

同一个NLP蛋白基因在侵染不同寄主的过程中，表达模式也是有差异的。大丽轮枝菌(Verticilliumdahliae)是一种半活体营养型真菌，至少能侵染200多种植物，包括向日葵、茄子、辣子、番茄、烟草、棉花等。大丽轮枝菌NLP1和NLP2蛋白被检测到具有细胞毒性，在侵染番茄时，两个基因表达模式一致，从接种第4天开始表达，第12天达到峰值。而在侵染本氏烟时，NLP2在整个侵染阶段未表达，NLP1在接种第4天开始表达，但在第8天就达到峰值[27]。

3 NLP蛋白毒性功能

3.1 NLP蛋白诱导植物细胞坏死

能够引起细胞坏死的NLP蛋白称为有细胞毒性NLP蛋白(cytotoxic NLP， cNLP)，不能引起坏死的为无细胞毒性NLP蛋白(noncytotoxic NLP， ncNLP)。cNLP蛋白能够渗透和分解植物细胞壁，引发细胞溶解，导致细胞坏死[1]。研究者对不同种类的病原菌测序发现，每个病原菌基因组中均存在cNLP或者ncNLP蛋白，并且在数量上差异非常大。例如，大豆疫霉菌(P.sojae)中存在7个cNLP和11个ncNLP蛋白[28]。大丽轮枝菌(V.dahliae)V592株系含有2个cNLP和7个ncNLP蛋白[29]。在死体营养型病原菌灰霉菌(Botrytiscinerea)、椭圆葡萄孢(Botrytiselliptica)和核盘菌(Sclerotiniasclerotiorum)中，均只含有2个cNLP蛋白，没有ncNLP蛋白[30-32]。而在拟南芥霜霉菌(H.arabidopsidis)中，10个NLP蛋白均为ncNLP蛋白[24，33]。这并不奇怪，因为拟南芥霜霉菌是活体营养型病原菌，依赖寄主的活细胞来完成生长和繁殖，如果分泌cNLP蛋白来杀死寄主，将会导致无法在寄主上定殖。到目前为止，cNLP蛋白只能在双子叶植物中引起细胞坏死和乙烯的产生[17，34-37]，在单子叶植物中不起作用[4，7，32，38-39]，表明NLP蛋白发挥细胞毒性功能需要双子叶植物的特异性靶蛋白或者特殊的细胞膜结构。

目前，鉴定cNLP蛋白常用的方法有两种。第一种是将NLP基因从病原菌中克隆出来，构建到植物表达载体中，通过农杆菌介导的瞬时转化法(常用无针头注射)将T-DNA转移到植物细胞中进行瞬时表达，检测是否能够引起植物细胞坏死，从而确定其是否具有细胞毒性[24，40]，该方法简单高效，应用最为广泛。另一种方法为活性引导纯化法(activity-guided purification)，通常在病原菌基因组和转录组数据未知的情况下应用较多。具体流程是先将NLP蛋白从病原菌的培养液中分离纯化出来，然后检测纯化后的蛋白是否具有诱导植物细胞坏死活性，从而确定是否为cNLP蛋白，最后将蛋白测序[18，41-42]。检测纯化蛋白诱导细胞坏死活性有3种方法。第一种方法是将纯化后的蛋白配成适宜浓度的溶液后，用无针头注射器将蛋白溶液注射到植物叶片的质外体区域，该方法成熟有效，应用广泛[37]。第二种是利用蒸腾作用的原理，将蛋白从叶片木质部运输到质外体中。具体做法是将叶柄置于蛋白质溶液中，在适宜条件下放置一段时间后，观察叶片是否有坏死[4]。最后一种方法运用了表面活性剂对植物的渗透作用原理，在蛋白溶液中混入表面活性剂后，再喷洒植物，使蛋白进入植物组织[35]，该方法已应用于一种专门杀死双子叶植物的除草剂[43]。

3.2 NLP蛋白诱导植物细胞坏死的分子机制

NLP蛋白被发现能够诱导植物细胞坏死之后，研究人员为了揭示该分子机制进行了大量研究，并取得了重要的进展。最开始，NLP蛋白被证明与海葵溶细胞素(actinoporins)的结构非常相似[44-45]，这种细胞素是成孔毒素(pore-forming toxin，PFT)的一类，能够结合鞘磷脂从而破坏细胞膜的完整性导致细胞死亡[46]。随后，研究发现烟草细胞膜上的糖基肌醇磷酸神经酰胺(GIPC)作为毒素受体可以与NLP蛋白特异性结合。NLP蛋白与GIPC暴露出来的糖头部基团相结合，大多数单子叶植物GIPC有3个己糖单位，而双子叶植物GIPC只有2个己糖单位，因此GIPC头部基团的长度差异可能是单子叶植物对cNLP蛋白不敏感的原因[47]。最近，Chen等[48]采用数量性状基因座(quantitative trait locus， QTL)定位的方法，以稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)的MoNLP1作为激发子，在拟南芥4号染色体上克隆到一个只有LRR(leucine-rich repeat)结构域的基因NTCD4。该基因编码的蛋白能够被分泌到质外体中，与NLP蛋白互作，加速NLP蛋白寡聚化。NTCD4蛋白3号位氨基酸天冬氨酸(D)自然遗传变异成天冬酰胺(N)后，NTCD4蛋白分泌效率降低，灰霉病感病率也下降。基于前期研究，作者提出了一个cNLP蛋白诱导细胞坏死的工作模型：首先，可溶性NLP蛋白单体被病原菌分泌到植物质外体中，与细胞膜上GIPC的糖头部基团相结合；然后在植物NTCD4蛋白的帮助下，NLP的二聚体、四聚体、八聚体或更大的寡聚体在膜表面进行组装；最后，由于GIPC可能充当一种 Ca2+通道，NLP的寡聚化可能会直接扰乱该通道，或与其他成分相互作用以激活Ca2+依赖的反应，从而瓦解植物细胞[48]。

3.3 NLP蛋白作为毒力因子对病原菌致病性的影响

虽然NLP蛋白在病原真菌、细菌和卵菌中具有高度的保守性，但它们对病原菌致病力的贡献差别较大。为了验证NLP蛋白对病原菌致病性的影响，研究人员构建了大量不同病原菌的突变体，将病原菌中的NLP基因进行突变、缺失或者过表达后，它们对寄主的侵染能力表现出很大的差异。对番茄具有致病性的大丽轮枝菌(V.dahliae)JR2菌株中7个NLP蛋白，仅NLP1和NLP2具有细胞毒性。NLP1 或NLP2 基因的缺失突变体菌株对番茄和拟南芥的致病力显著降低，并且NLP1基因缺失对致病力影响更大。同时，缺失NLP1后对本氏烟的致病力减弱，并表现出气生菌丝增多，分生孢子数减少40%。而NLP2的缺失突变体对本氏烟致病力无影响[27]。类似地，马铃薯黑胫病菌(Pectobacteriumatroseptica)和胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)的cNLP单基因突变体菌株对马铃薯致病力都显著减弱，并且马铃薯黑胫病菌的单突变体对马铃薯茎秆致病力也减弱[42，49]。在炭疽病菌(Colletotrichumcoccodes)中过表达尖孢镰刀菌(F.oxysporum)的nep1基因后，病原菌对野草苘麻(Abutilontheophrasti)的致病性明显增强[50]。以上研究表明，在一些病理系统中，NLP蛋白可以充当毒力因子，正向调控病原菌的致病性。

相比之下，古柯枯萎病菌(F.oxysporumf. sp.erythroxyli)对古柯(E.coca)的致病性既不受Nep1 基因失活的影响，也不受Nep1过表达的影响[51]。同样，感染棉花的大丽轮枝菌(V.dahliae)V592菌株中NLP1和NLP2蛋白虽然对棉花、本氏烟和拟南芥均有细胞毒性，并且还能造成棉花子叶萎蔫，但NLP1和NLP2基因的单突变或者双突变菌株对棉花的致病性均无影响[29]。将禾生球腔菌(Mycosphaerellagraminicola)侵染寄主时早期表达的cNLP基因缺失后，其致病力和无性繁殖均不受影响[44]。稻瘟菌(M.oryzae)中存在4个NLP蛋白，其中MoNLP1、MoNLP2和MoNLP4具有细胞毒性，MoNLP3无细胞毒性。将这4个NLP基因同时缺失后，突变体菌株对水稻的致病力没有任何变化，菌体生长和野生型也无差别[52]。由于半活体营养型卵菌基因组编码扩展的NLP基因库中基因数量较多，将所有基因进行缺失构建突变体尚无法完成。因此，cNLP蛋白对半活体营养型卵菌的致病性贡献目前仍不清楚。

4 NLP蛋白激发植物免疫反应

NLP蛋白能够激发双子叶植物免疫反应在众多研究中已经被证实。例如，狭长孢灵芝(Ganodermaboninense)GbNEP蛋白能够激发烟草的过氧化氢和超氧化物的积累[39]。寄生疫霉菌(Phytophthoraparasitica)NLPPp蛋白能够激发拟南芥复杂的免疫反应，包括MAPK激酶转录激活，胼胝质沉积，一氧化氮(NO)、活性氧(ROS)、乙烯和植物抗毒素等物质的释放[7]。灰霉菌(B.cinerea)BcNEP1和BcNEP2能够激发本氏烟原生质体ROS的积累[38]。稻瘟菌(M.oryzae)Nep1Mo蛋白激发本氏烟ROS的积累，气孔关闭，NO和保卫细胞Ca2+的释放，从而提高了本氏烟对烟草疫霉菌(Phytophthoranicotianae)的抗性[53]。

然而，免疫反应是NLP蛋白发挥细胞毒性引起细胞死亡间接导致的，还是由NLP直接激发的并不清楚。为了揭示NLP蛋白细胞毒性和激发免疫反应功能之间的关系，Ottmann等[11]将胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum)中的属于类型Ⅱ的PccNLP蛋白进行点突变，形成不同折叠类型的突变体。结果显示，突变体表现出的细胞毒性和激发免疫反应的功能是一致的，表明PccNLP的细胞毒性和激发免疫反应需要相同的蛋白折叠类型，并且它触发的植物免疫反应是因为其细胞毒性破坏了宿主细胞完整性引起细胞死亡而间接导致。将PccNLP蛋白95 ℃高温灭活后，细胞毒性和激发免疫反应功能都丧失，进一步证实了它激发免疫反应是细胞毒性间接导致的[10]。然而，Oome等[13]通过研究拟南芥霜霉菌(H.arabidopsidis)中的ncNLP蛋白功能有了新的发现。10个无细胞毒性的HaNLPs基因分别转化拟南芥后，有7个HaNLPs基因的转化植株免疫反应被过度激活，转基因植株表现出强烈的生长减弱，甚至死亡，并且对拟南芥霜霉病抗性显著增强，充分证实了激发免疫反应和细胞毒性是NLP蛋白两个相互独立的功能。对HaNLP3深入研究发现，其在拟南芥中激发的抗病相关基因与MAMP(microbe-associated molecular pattern)分子flg22和BTH(苯并噻二唑，水杨酸类似物)激发的上调表达基因大部分重叠，充分说明HaNLP3是一个典型的MAMP分子。有趣的是，长度只有28个氨基酸的HaNLP3缺失突变体仍能够激发拟南芥免疫反应，导致植株生长减弱。这28个氨基酸的肽段中，包含了类型Ⅰ的NLP蛋白特有的保守结构域。根据这个肽段，人工合成一段更短的24个氨基酸的多肽nlp24，依旧能激发抗病相关基因的表达和植物乙烯的合成，从而提高对霜霉病的抗性。细菌枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)的BsNPP1和真菌灰霉菌(B.cinerea)的BcNep2蛋白结构中存在nlp24相似肽段，同样能够激发拟南芥强烈的免疫反应，表明细菌、真菌和卵菌这三种不同微生物中，类型Ⅰ的NLP蛋白保守氨基酸序列可以作为MAMP分子触发拟南芥免疫反应[13]。与此相反，胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum)中的PccNLP是属于类型Ⅱ的NLP蛋白，含有的多肽nlp26不能激发拟南芥免疫反应，很可能是因为类型Ⅰ的nlp24和类型Ⅱ的nlp26保守结构域不同导致[13]。寄生疫霉菌(P.parasitica)的PpNLP蛋白属于类型Ⅰ，具有细胞毒性和激发拟南芥免疫反应功能，突变或95 ℃高温灭活后，细胞毒性丧失，但仍能够激发拟南芥PR-1、PAD3基因的表达和乙烯的释放，再次证明了细胞毒性和激发免疫反应是NLP两个相互独立的功能[10]。以上研究表明，类型Ⅰ和类型Ⅱ的NLP蛋白激发免疫反应的机理是有差异的，类型Ⅰ的NLP蛋白激发免疫反应和细胞毒性无关，两个功能相互独立，而类型Ⅱ的NLP蛋白激发免疫反应是由细胞毒性间接导致的。

近期，研究者发现NLP蛋白激发了一种新的免疫反应。寡雄腐霉菌(P.oligandrum)的PyolNLP5 和 PyolNLP7属于类型Ⅱ的 NLP蛋白，能够显著提高茄科植物(本氏烟、番茄、辣椒)对辣椒疫霉菌(P.capsici)的抗性。但它们和类型Ⅰ的NLP蛋白不同，不能激发ROS的积累，而是诱导了具有抗菌功能的植物防御素基因的表达，并且依赖于保守的nlp24多肽[54]。当然，并不是所有的NLP蛋白都能够激发植物免疫反应，许多ncNLP蛋白就没有该功能，比如拟南芥霜霉菌(H.arabidopsidis)的NLP1、NLP7和NLP8均不能激发免疫反应[13]。

5 NLP蛋白被植物识别

当植物受到病原菌侵袭时，植物免疫系统可以通过受体样蛋白 (RLP) 或受体样激酶 (RLK)等模式识别受体(pattern recognition receptors， PRRs)来识别大多数已知的(病原体衍生的)模式，从而产生相应的免疫反应，比如PTI(PAMP-triggered immunity)或者MTI(MAMP-triggered immunity)[55]。揭示NLP蛋白被植物识别的一项重大突破是鉴定出了拟南芥中介导 NLP 触发免疫反应的受体复合物RLP23-SOBIR1-BAK1[56]。RLP23是拟南芥中的一个亮氨酸重复序列受体蛋白(leucine-rich repeat receptor protein， LRR-RP)，蛋白结构中包含了由27个富含亮氨酸重复序列 (LRR) 组成的胞外域、一个跨膜域和一个由17个氨基酸组成的小胞质尾。其中，RLP23蛋白在体内和体外均能与大多数类型Ⅰ的NLP蛋白的nlp20保守肽段相结合，从而激活拟南芥的免疫反应，并且结合部位为LRR结构域。在对nlp20不敏感的拟南芥(rlp23突变体、Bor-4和Kyoto)和茄科植物(烟草、马铃薯和番茄)中稳定表达RLP23基因后，植株表现出敏感性，并在体内合成乙烯，表明植物需要RLP23去特异性识别nlp20。由于RLP23缺乏明显的细胞质信号结构域，需要与LRR受体激酶SOBIR1形成组成型的、不依赖于配体的复合物，在细胞内完成信号转导。并在配体结合后才募集第二个LRR受体激酶BAK1到三元复合物中。拟南芥sobir1突变体和bak1-5/bkk1突变体不能响应nlp20，表明RLP23识别nlp20需要SOBIR1和BAK1的参与。与其他模式识别受体类似，RLP23可用于农作物抗病育种，增强植物抗病性。比如在马铃薯中异位表达RLP23基因后，植株能够识别NLP蛋白激活免疫反应，从而增强了对晚疫病菌(P.infestans)和核盘菌 (S.sclerotiorum)抗性[56]。

胡萝卜软腐果胶杆菌(P.carotovorum)中的属于类型Ⅱ的PccNLP蛋白能引起拟南芥细胞坏死，并且能够激发PR1、PAD3基因表达和乙烯的合成等免疫反应[10]。而PccNLP中的nlp26肽段不能激发拟南芥免疫反应[13]，表明拟南芥识别PccNLP蛋白是nlp26以外的其他区域，是区别于RLP23识别nlp24的另一种模式。

拟南芥并不是唯一识别nlp20的植物，小花南芥(Arabisalpina)、菥蓂(Thlaspiarvense)和刚葶苈(Drabarigida)等十字花科植物也能响应nlp20。有趣的是，菊科植物莴苣(Lactucasativa)也能够识别nlp20，激发乙烯的合成及对莴苣霜霉菌(Bremialactucae)的抗性[57]。相比于拟南芥，莴苣还能识别类型Ⅱ的PccNLP蛋白的nlp26肽段，激发免疫反应。莴苣和拟南芥的亲缘关系并不密切，因此很可能已经独立进化出了识别 NLP 的能力。并且莴苣基因组中没有RLP23的直系同源基因[58]，表明莴苣识别NLP蛋白是由其他受体蛋白介导的，而具体的受体蛋白尚未鉴定出来[57]。

瓜类炭疽菌(C.orbiculare)的CoNLP1基因属于类型Ⅰ，具有细胞毒性，在营养型转变的阶段表达[22]。将其在孢子中组成型表达后，黄瓜在侵染早期就形成胼胝质和积累ROS，阻碍病原菌的侵染。然而，组成型表达没有毒性的CoNLP1突变体后，病原菌依旧不能侵染黄瓜。表明病原菌无法侵染寄主与CoNLP1细胞毒性无关。CoNLP1具有MAMP分子功能的nlp24肽段，合成的Conlp24能激发拟南芥免疫反应。将Conlp24上位于第2位、3位和4位的异亮氨酸(I)、蛋氨酸(M)和酪氨酸(Y)全部突变成丙氨酸(A)，形成突变体Conlp24Mut，则对拟南芥不起作用。有趣的是，表达CoNLP1Mut基因(结构中含有Conlp24Mut)的病原菌仍无法感染黄瓜，说明寄主识别CoNLP1不依赖于nlp24，而是其他肽段。进一步缺失试验分析表明，CoNLP1蛋白C末端由32个氨基酸组成的肽段才是黄瓜识别的关键区域，该肽段足以激活黄瓜免疫反应，从而阻止了炭疽菌的侵染[23]。

以上研究表明，植物至少已经进化出了4种不同的识别NLP蛋白的系统，充分说明NLP蛋白在病原菌侵染寄主过程中发挥了至关重要的作用。

6 问题与展望

研究植物病原菌分泌蛋白功能能够为揭示病原菌与寄主互作机制奠定理论基础。作为非常重要的一类质外体分泌蛋白，NLP蛋白在病原菌与寄主互作过程中所发挥的功能被国内外学者进行了大量研究，但是仍有许多问题亟待进一步阐释。截至目前，类型Ⅱ和类型Ⅲ的NLP蛋白鲜有研究，这两类和类型Ⅰ的NLP蛋白功能有何区别还不清楚。cNLP蛋白诱导细胞坏死，便于病原菌在死体营养阶段获取营养，有利于病原菌定殖。而ncNLP蛋白对于病原菌成功定殖有何贡献尚需进一步研究。cNLP蛋白不能诱导单子叶植物细胞坏死，那么感染单子叶植物的病原菌中的cNLP蛋白发挥了什么功能也值得深究。已经证实NLP蛋白作为MAMP被植物模式识别受体识别，激发免疫反应。除了拟南芥中已经被发掘的受体蛋白RLP23之外，其他识别系统的植物受体蛋白有哪些，以及这些受体蛋白是否能够直接应用于农作物抗病育种也是在今后研究中需要解决的科学问题。