NaCl胁迫对冬油菜种子萌发和生理特性的影响

许耀照，曾秀存，王振朝，党仕卓，刘永晶

(1.河西学院 农业与生态工程学院，甘肃 张掖734000； 2.甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室，甘肃 张掖734000； 3.河西学院 生命科学与工程学院，甘肃 张掖734000)

土壤盐碱化是降低土壤生产力和阻碍农业生产的重要非生物胁迫之一，现已成为农业发展面临的一个难题。高盐碱胁迫是最为严重的一种非生物环境胁迫之一，它损害全球20%灌溉土地的作物生产[1]。我国盐碱化土壤总面积约1亿hm2，约占世界盐碱地面积的10%，耕地中盐渍化面积高达920.9万hm2，占全国耕地面积的6.62%[2-4]。耕地中积累的盐主要来源于灌溉水中的NaCl[5]，土壤中盐浓度过高会降低植物吸水能力，也抑制植物对矿质元素K的吸收，还会诱导产生活性氧(ROS)，影响细胞膜完整性和各种酶活性[6]。我国北方盐碱地分布范围广、面积大、土地利用率低，不但影响粮食产量，而且造成突出的生态环境问题，仅我国西部陕西、甘肃、宁夏、青海、内蒙古和新疆6省(自治区)盐渍土面积占全国盐渍土面积的69.03%[7]。由于自然因素、农业生产中不合理的耕作、栽培和灌溉方式等原因，土壤盐碱化日益恶化，生态系统遭到破坏，次生盐碱地面积逐年扩大，严重影响到作物产量提高和农业的可持续发展。

油菜(BrassicanapusL.)是我国第一大油料作物，常年种植面积维持在660万hm2以上，约占国内食用油比例的50%[8]。油菜被认为是中度耐盐植物，但盐害导致油菜产量降低最高可达60%[9]。随着油菜种植北移的成功[10]，油菜可适应北方地区种植和推广，但盐渍化严重影响油菜生长发育和产量增加。因此开展油菜耐盐性研究，合理利用北方盐渍化土地资源，对改善生态环境、发展灌溉农业具有重要的意义[11]。研究表明，油菜耐盐性存在差异，NaCl胁迫显著抑制白菜型冬油菜种子萌发，且胚根长对盐胁迫更敏感，随着盐胁迫程度增加，幼苗叶片脯氨酸含量、电导率、丙二醛(MDA)含量逐渐上升，过氧化物酶(POD)活性呈先升高后降低趋势[11]。龙卫华[9]认为鉴定甘蓝型油菜耐盐性的最适盐浓度为214 mmol·L-1。高芥酸油菜在萌发阶段的耐NaCl性明显优于低芥酸油菜[12]。郭月等[13]在甘蓝型油菜杂交中筛选到1 078个芽苗期差异表达基因(DEG)，这些基因与耐盐杂种优势密切相关。种子萌发和幼苗期是决定植物在盐胁迫下生存的关键时期[14-17]，种子萌发期的耐盐程度可作为耐盐性筛选与鉴定的依据之一[18]。油菜种子萌发期是对盐胁迫最敏感的时期之一，萌发期耐盐性越强，越有利于油菜成苗和形成壮苗，为增加产量奠定基础。本研究以冬油菜为研究对象，设置5个盐浓度，研究冬油菜在盐胁迫下种子萌发、生理特性、耐盐性评价指标和耐盐临界值，为冬油菜品种抗盐种质筛选与创新提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

白菜型冬油菜为陇油16号(甘肃省油菜工程技术研究中心选育)、天油2号和天油4号(甘肃省天水市农业科学研究所选育)，甘蓝型冬油菜为宁油2号(江苏省农业科学院经济作物研究所选育)。NaCl为分析纯(AR)。

1.2 试验方法

试验于2019年1—11月在河西学院甘肃省河西走廊特色资源利用重点实验室进行。挑选饱满、大小均匀的种子，用0.1%的KMnO4消毒10 min，无菌水冲洗3～4次，用滤纸吸干外附水分，然后用蒸馏水浸种6 h，蒸馏水的体积是浸种油菜种子体积的6～8倍；在直径12 cm的玻璃培养皿底铺双层滤纸，将种子分别均匀排列在滤纸上，每个培养皿铺100粒种子，重复3次。加入不同浓度的NaCl溶液8 mL，以滤纸充分吸湿为宜；然后将培养皿置于光照培养箱(RDN-400D-4人工气候培养箱，宁波东南仪器有限公司制造)中，培养箱温度为(25±1) ℃。根据NaCl浓度筛选预备试验结果，将NaCl浓度分别设置为34、68、102、136、170 mmol·L-1，用蒸馏水作对照(CK)。培养期间，每天定时观察，用称量法补充培养皿所蒸发的水分，从处理的第2天开始，连续记录冬油菜种子的发芽情况。

1.3 测定项目与方法

从种子置床开始每天观察记录，第7天统计发芽率，发芽率=正常发芽的种子数/供试种子数×100%。每培养皿随机取10粒萌发种子，第10天用直尺测其胚芽长度、胚根长度；用蒸馏水洗净，滤纸吸干水分，用分析天平称其鲜重，然后105 ℃杀青15 min，于80 ℃烘箱内烘干至质量不变，称其干重。

盐害指数=(对照发芽率-胁迫下发芽率)/对照发芽率×100%。

耐盐临界值：与盐胁迫呈正相关的指标增加到对照的200%时所对应的盐浓度，或者与盐胁迫强度呈负相关的指标降低到对照的50%对应的盐浓度[19]。相应指标和盐胁迫存在相关性，则进行回归分析，根据回归方程求出耐盐临界值，盐胁迫指标达到相对照指标75%、50%和10%时盐浓度即是耐盐临界值(S75)、半致死浓度(S50)和致死浓度(S10)[20]。

幼苗生理指标测定：细胞膜透性采用电导率仪法[21]，MDA含量采用硫代巴比妥酸法[21]；游离脯氨酸含量采用磺基水杨酸法[21]；POD活性采用愈创木酚法[21]。

1.4 数据处理

用Excel 2019软件制表，用DPS v9.01软件进行差异显著性和相关性分析。

2 结果与分析

2.1 NaCl胁迫对冬油菜种子发芽率的影响

由表1可以看出，随着NaCl浓度的增加，冬油菜种子发芽率逐渐降低，且白菜型冬油菜种子发芽率受抑制程度小于甘蓝型冬油菜。与对照相比，NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号和天油4号的发芽率无显著差异，宁油2号的发芽率显著(P<0.05)降低。NaCl浓度超过68 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的发芽率均显著低于对照，NaCl浓度为170 mmol·L-1时，宁油2号种子发芽率降低到63.33%。这表明，低浓度NaCl(34 mmol·L-1)对白菜型冬油菜种子的发芽率影响不明显，但对甘蓝型冬油菜种子的发芽率有明显影响，高浓度NaCl(超过68 mmol·L-1)明显抑制冬油菜种子发芽率。

表1 NaCl胁迫下冬油菜种子发芽率的变化

2.2 NaCl胁迫对冬油菜幼苗胚根长和胚芽长的影响

由表2可以看出，随着NaCl浓度的增加，冬油菜幼苗的胚根长逐渐变短。与对照相比，NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号和天油4号幼苗胚根生长受到显著抑制，天油2号和宁油2号幼苗胚根长无显著变化；NaCl浓度超过68 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的幼苗胚根显著短于对照。这表明，NaCl浓度超过68 mmol·L-1时会抑制冬油菜幼苗胚根生长。

随着NaCl浓度增加，冬油菜幼苗胚芽生长显著受到抑制，白菜型冬油菜胚芽长受抑制幅度小于甘蓝型冬油菜(表2)。与对照相比，NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号幼苗的胚芽长无显著变化；NaCl浓度为68 mmol·L-1时，陇油16号、天油4号和宁油2号幼苗的胚芽显著变短；NaCl浓度达到102 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的胚芽长均显著变短，宁油2号的胚芽长受抑制幅度最大。这表明NaCl浓度超过102 mmol·L-1时可显著抑制冬油菜幼苗胚芽生长。

表2 NaCl胁迫下冬油菜幼苗胚根长和胚芽长的变化

2.3 NaCl胁迫对冬油菜幼苗鲜重和幼苗干重的影响

由表3可以看出，随着NaCl浓度增加，冬油菜幼苗鲜重和幼苗干重均逐渐降低，且白菜型冬油菜幼苗鲜重降低幅度大于甘蓝型冬油菜。与对照相比，当NaCl浓度为34 mmol·L-1时，天油2号和天油4号幼苗鲜重和幼苗干重无明显下降，陇油16号和宁油2号幼苗的鲜重和幼苗干重显著下降；NaCl浓度达到68 mmol·L-1及以上时，陇油16号、天油4号和宁油2号幼苗鲜重和幼苗干重均显著低于对照。这表明高浓度NaCl(68 mmol·L-1及以上)会显著抑制冬油菜幼苗干物质积累。

表3 NaCl胁迫下冬油菜幼苗鲜重和幼苗干重的变化

2.4 NaCl胁迫对冬油菜幼苗脯氨酸含量和细胞膜透性的影响

由表4可以看出，随着NaCl浓度增加，冬油菜幼苗脯氨酸含量和细胞膜透性逐渐增加，且白菜型冬油菜幼苗脯氨酸含量增加幅度大于甘蓝型冬油菜。与对照相比，当NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号和天油4号幼苗脯氨酸含量无显著升高，天油2号和宁油2号幼苗脯氨酸含量显著升高；当NaCl浓度达到68 mmol·L-1及以上时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的脯氨酸含量均显著升高。与对照相比，当NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号、天油4号和宁油2号幼苗细胞膜透性显著增大，天油2号幼苗细胞膜透性无显著增大；当NaCl浓度达到68 mmol·L-1及以上时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的幼苗细胞膜透性均显著增大。以上结果说明高浓度NaCl(68 mmol·L-1及以上)使冬油菜幼苗脯氨酸含量显著升高、细胞膜透性显著增大。

表4 NaCl胁迫下冬油菜幼苗脯氨酸含量和细胞膜透性的变化

2.5 NaCl胁迫对冬油菜幼苗MDA含量和POD活性的影响

由表5可以看出，随着NaCl浓度增加，冬油菜幼苗MDA含量和POD活性逐渐升高，且白菜型冬油菜幼苗MDA含量和POD活性升高幅度大于甘蓝型冬油菜。与对照相比，当NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号、天油2号和天油4号幼苗MDA含量显著升高，宁油2号幼苗MDA含量无显著升高；当NaCl浓度达到68 mmol·L-1及以上时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的幼苗MDA含量均显著高于对照。与对照相比，当NaCl浓度为34 mmol·L-1时，陇油16号和天油2号幼苗POD活性显著增强，天油4号和宁油2号幼苗POD活性无显著增强；当NaCl浓度达到136 mmol·L-1及以上时，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的幼苗POD活性均显著增强。表明高浓度NaCl(136 mmol·L-1及以上)胁迫下冬油菜幼苗MDA含量和POD活性显著提高。

表5 NaCl胁迫下冬油菜幼苗丙二醛含量和过氧化物酶活性的变化

2.6 指标间相关性

相关分析(表6)表明，冬油菜种子发芽率与胚根长、胚芽长、幼苗鲜重和干重呈极显著正相关，而与幼苗MDA含量、细胞膜透性、脯氨酸含量、POD活性呈极显著负相关；胚根长与胚芽长、幼苗鲜重和幼苗干重呈极显著正相关，而与幼苗MDA含量、细胞膜透性、脯氨酸含量、POD活性呈极显著负相关；胚芽长与幼苗鲜重和幼苗干重呈极显著的正相关，而与幼苗MDA含量、细胞膜透性、脯氨酸含量、POD活性呈极显著负相关；幼苗MDA含量与细胞膜透性、脯氨酸含量和POD活性呈极显著正相关。

表6 冬油菜种子萌发和生理指标间相关性

2.7 耐盐临界值和盐害指数

由表7可以看出，以NaCl浓度为横坐标，以发芽率、胚根长、胚芽长、幼苗鲜重和干重的相对变化率指标为纵坐标，建立线性回归方程，得出冬油菜种子萌发耐盐临界值(S75)、半致死浓度(S50)和致死浓度(S10)。冬油菜种子发芽率的耐盐临界值(S75)为164.87～251.99 mmol·L-1，耐盐半致死浓度(S50)为316.29～494.95 mmol·L-1，耐盐致死浓度(S10)为558.57～883.67 mmol·L-1，耐盐临界值(S75)、半致死浓度(S50)和致死浓度(S10)由高到低依次是陇油16号、天油2号、天油4号、宁油2号。发芽率、胚根长、胚芽长、幼苗鲜重和幼苗干重的均值耐盐临界值(S75)、均值半致死浓度(S50)和均值致死浓度(S10)由高到低依次是陇油16号、天油2号、天油4号、宁油2号。胚根长的耐盐临界值最低，陇油16号、天油2号、天油4号和宁油2号的胚根长耐盐临界值分别为44.74、49.47、51.54、55.82 mmol·L-1，冬油菜萌发生长指标的耐盐临界值表现为发芽率>胚芽长>幼苗鲜重>幼苗干重>胚根长。

由表8可以看出，冬油菜品种盐害指数随着NaCl浓度增加呈上升趋势，且白菜型冬油菜盐害指数小于甘蓝型冬油菜。NaCl浓度在68～136 mmol·L-1时，冬油菜各品种平均盐害指数变化范围在6.09%～16.46%。NaCl浓度为170 mmol·L-1时，宁油2号的盐害指数最高，达到29.63%。各冬油菜品种间盐害指数均值为宁油2号>天油4号>天油2号>陇油16号。

3 结论与讨论

种子萌发和幼苗生长是对盐胁迫逆境反应最敏感的时期，也是品种表现盐适应的关键阶段[14]。不同浓度盐胁迫普遍抑制植物生长[22]。盐胁迫对植物种子萌发的影响与盐的质量浓度、种类，以及植物本身的遗传特性有关，一是土壤中盐分含量增加导致种子吸水困难，影响种子萌发[23]，二是离子浓度过高产生离子毒害[24]。斯琴巴特尔等[25]研究表明，盐胁迫抑制玉米种子发芽和玉米幼苗地上部的生长。孙君艳等[26]研究发现，高浓度盐处理对小麦种子萌发和幼苗生长起抑制作用。张国伟等[27]研究表明，150 mmol·L-1NaCl为棉花耐盐性鉴定的适宜盐浓度。本研究表明，盐胁迫下白菜型冬油菜和甘蓝型冬油菜种子发芽率与对照相比都有不同程度下降，低盐浓度下白菜型冬油菜种子发芽率影响较小，而甘蓝型冬油菜种子发芽率影响较大，高盐浓度下白菜型和甘蓝型冬油菜种子发芽率均显著降低，这与龙卫华等[28]的研究结果一致，即发芽期耐盐性白菜型油菜表现最好，甘蓝型油菜次之。鲜重和干重是评价植物耐盐性强弱的可靠指标，盐胁迫抑制冬油菜种子幼苗胚根长、胚芽长，尤其对胚根长抑制作用明显，随着盐浓度增加，胚根长、胚芽长、幼苗干重和鲜重均显著下降，说明盐胁迫不仅影响冬油菜种子萌发，而且影响冬油菜种子幼苗干物质积累。

在盐胁迫条件下，若半致死浓度高说明植物对盐胁迫的抗性强[20]。本研究发现，冬油菜种子萌发耐盐临界值存在差异，白菜型冬油菜耐盐临界值较高，而甘蓝型冬油菜耐盐临界值较低，这表明冬油菜耐盐性存在差异，白菜型冬油菜抗盐性强于甘蓝型冬油菜。

当植物处于逆境时，体内活性氧产生和清除的动态平衡被打破，将积累H2O2和羟自由基等活性氧自由基。自由基会造成植物膜脂过氧化，破坏膜结构的完整性，严重时引起细胞死亡[29]。Mukherjee等[30]认为，盐胁迫会导致植物活性氧的产生，也会导致植物清除代谢机制紊乱，影响植物正常生长发育。已有研究证实，脯氨酸积累是激活植物体内生物合成脯氨酸和抑制脯氨酸降解共同导致[31]，盐胁迫越严重，植物体内脯氨酸生物合成系统激活越彻底，脯氨酸含量增加越明显。随着盐胁迫程度增加，各品种的细胞膜透性增加，表明细胞膜受伤程度严重。MDA的产生使生物膜损伤加剧，MDA含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度[32]。POD是植物体内清除H2O2的主要酶类之一，其可以缓解和避免膜内不饱和脂肪酸的过氧化作用，维持细胞膜的完整性来提高植物抗逆性。本研究中，高盐浓度下，冬油菜幼苗脯氨酸含量，细胞膜透性、MDA含量和POD活性都显著增加，不同品种增加幅度不同，表明不同品种冬油菜幼苗的耐盐性存在差异。

植物耐盐性强弱不能用单一指标去衡量[33]。吕晋慧等[34]把叶片细胞膜透性、脯氨酸和可溶性糖含量作为茶菊耐盐性鉴定指标；张春兰等[35]以叶面积、主根长和MDA含量作为大豆耐盐性的指标；高英波等[36]以发芽率、发芽势、胚芽长和胚芽重的相对值作为夏玉米耐盐性评价指标。张国伟等[27]把发芽率作为棉花萌发期耐盐的指标。本研究结果表明，冬油菜种子发芽率与幼苗生长指标、胚根长与幼苗生物量积累、幼苗MDA含量与生理指标呈极显著正相关，因此，冬油菜耐盐性鉴定指标可以选用种子发芽率、胚根长和MDA含量。

盐胁迫对冬油菜种子萌发指标和生理响应具有明显影响。盐胁迫下冬油菜种子萌发延迟，胚根和胚芽生长受抑制，幼苗鲜重和幼苗干重显著降低，白菜型冬油菜降幅小于甘蓝型冬油菜；幼苗脯氨酸含量、细胞膜透性、MDA含量和POD活性显著增加，冬油菜种子发芽率与胚根长、胚芽长、幼苗鲜重和干重呈极显著正相关，而与幼苗MDA含量、细胞膜透性、脯氨酸含量、POD活性呈极显著负相关。冬油菜种子萌发生长指标的耐盐临界值为164.87～251.99 mmol·L-1，耐盐半致死浓度为316.29～494.95 mmol·L-1，耐盐致死浓度为558.57～883.67 mmol·L-1。各品种耐盐临界值为陇油16号>天油2号>天油4号>宁油2号。本研究仅对冬油菜种子萌发期的耐盐性进行了比较，为保证冬油菜耐盐可靠性，后续应根据种子萌发期比较结果进行苗期耐盐性和盐土萌发验证，以便更好地指导生产实践。