PACAP作用于神经胶质瘤的研究进展*

陈丹丹 综述，刘娟娟，李 丽 审校

(山东中医药高等专科学校医学系，山东 烟台 264100)

垂体腺苷酸环化酶激活多肽(PACAP)是1989年由ARIMURA等从绵羊下丘脑中分离出的一种内源性神经肽，因其具有刺激大鼠垂体前叶细胞中环磷酸腺苷(cAMP)的合成而命名。PACAP包括含有38个氨基酸的PACAP-38和含有27个氨基酸的PACAP-27。PACAP-38羧基末端(C端)第27位点(Gly28-Lys29-Arg30)酰胺化后形成PACAP-27，二者在氨基末端(N端)保有相同的27位氨基酸序列，都具备激活腺苷酸环化酶(AC)的作用。其中，人类的PACAP-27与血管活性肠肽(VIP)有68%的氨基酸序列保守性，因此PACAP被认为是分泌素/胰高血糖素/生长激素释放激素/VIP超家族新的成员。研究表明，VIP和PACAP都是体内广泛分布的肽类激素，在许多不同的器官和组织中充当神经递质，具有多种生物活性[1-2]。

1 PACAP与信号通路

1.1PACAP及其受体 PACAP和VIP通过在体内与细胞膜上的B家族G蛋白偶联受体特异性结合而发挥作用。根据PACAP和VIP 2种结合位点的特点进行分类：Ⅰ型位点与PACAP高度结合，是VIP的1 000多倍；Ⅱ型位点与VIP及PACAP亲和力相当。后者又被进一步细分为2类。随后，克隆出2类3型：与PACAP高度结合而与VIP亲和力低的命名为PAC1受体(PAC1R)；与PACAP/VIP亲和力相当的命名为VPAC1受体(VPAC1R)和VPAC2受体(VPAC2R)。由于PAC1R第1个或第2个28氨基酸残基组成的“hop”和“hip”盒不同，PAC1R又可以分为不同的亚型，其中Null、Hop1和Hop2亚型均参与AC和磷脂酶C(PLC)信号通路，而hip亚型仅诱导AC激活。VPACR是否存在亚型尚不清楚，主要参与AC信号通路。PACAP均可与上述受体亚型结合触发不同的信号通路：PAC1R与G蛋白偶联受体α亚单位激动型G蛋白(Gs)和PLC型G蛋白(Gq)结合，介导了AC/PLC/二酰基甘油(DAG)/肌醇1，4，5-三磷酸(IP3)信号级联。

1.2PACAP的分布 PACAP及其受体在全身不同的器官中广泛分布，包括神经系统、内分泌系统、生殖系统、消化系统等部位。在神经系统，PACAP作为神经递质，神经调质或神经营养因子，在神经元发育、保护和再生中起重要作用，并且在病理生理条件下可能具有一定的神经保护作用。PACAP不仅直接影响神经元功能，还影响许多神经胶质细胞的功能，同时在神经退行性疾病、创伤性脑损伤、肌萎缩侧索硬化、视网膜病变及神经系统肿瘤方面均参与疾病的发生发展，而且PACAP可以通过血脑屏障。在内分泌系统，PACAP可影响机体的体温调节、昼夜节律和心脏兴奋性等。在生殖系统，参与下丘脑-垂体-性腺轴的调节。PACAP在肿瘤作用方面具有争议，一方面其在某些情况下促进了细胞增殖；另一方面其通过诱导细胞凋亡来抑制肿瘤细胞增殖。

1.3PACAP参与的信号通路

1.3.1PACAP参与cAMP/PKA/CREB信号通路的调节 活化的PAC1R与Gs结合，促使腺苷三磷酸(ATP)经AC催化后生成cAMP，cAMP作为第二信使进一步激活蛋白激酶A(PKA)，PKA是cAMP作用的底物，其由2个催化亚基和2个调节亚基组成，cAMP与调节亚基结合后释放催化亚基，催化亚基释放进入细胞核与环磷腺苷反应原件结合蛋白(CREB)结合且在丝氨酸133位点(Ser133)磷酸化，磷酸化后的CREB与细胞核内的cAMP反应元件(CRE)特异性结合形成复合物，激活靶基因的表达[3]。cAMP/PKA/CREB信号通路的调节与神经系统内神经元的再生、修复，胶质细胞的功能有关[4]。

1.3.2PACAP参与PLC/PIP2/DAG/IP3/PKC信号通路 PAC1R与Gq蛋白结合，激活PLC，PLC将细胞膜上的脂酰肌醇4,5-二磷酸(PIP2)分解为DAG和IP3。IP3动员细胞内钙库释放钙离子(Ca2+)到细胞质中与钙调蛋白结合，随后参与靶蛋白磷酸化等一系列反应,DAG在Ca2+的协同下激活蛋白激酶C(PKC)，然后通过PKC引起靶基因转录等一系列级联反应，进行细胞的应答[5]。

1.3.3PACAP参与磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶(PI3K/Akt)信号通路 PI3Ks蛋白家族参与细胞增殖、分化、凋亡和葡萄糖转运等多种细胞功能的调节。PI3K活性的增加常与多种癌症相关[6]。实验证实，PACAP可能通过PI3K/Akt信号通路参与施万细胞髓鞘形成过程[7]。PAC1R与Gq蛋白结合激活PI3K，后者将质膜上的PIP2磷酸化，生成磷脂酰肌醇-3，4，5-三磷酸(PIP3)，PIP3作为第二信使与细胞内含有PH结构域的信号蛋白Akt结合，将胞浆中的Akt募集到质膜上，3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶-1(PDK1)和哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTOR2)激活Akt，促使Akt蛋白Thr308位点和Ser473位点磷酸化而致Akt活化[8]。活化的Akt通过磷酸化作用激活特异性底物，如p27、抗凋亡蛋白Bcl-2等，通过调控此类底物在胞浆和胞核的定位影响细胞的增殖周期和肿瘤进展[9-10]，或抑制如caspase-9、caspase-3等，抑制了肿瘤细胞的凋亡。

张力蛋白同源磷酸酶(PTEN)可以通过将膜上的Akt去磷酸化逆转形成PIP2，进而抑制PI3K/Akt信号通路，起到抑制胶质瘤进展[11]和血管新生的作用。另外，PACAP还通过PAC1受体参与丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶(MAPK/ERK)信号通路的激活来调节神经元兴奋性[12]。

2 PACAP对神经胶质瘤的影响

神经胶质瘤是原发性颅内肿瘤中最常见的一种。而成人中最常见的神经胶质瘤是弥漫性胶质瘤。弥漫性胶质瘤根据其细胞类型的不同分为星形胶质细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突-星形胶质细胞肿瘤等。星形细胞瘤是起源于星形细胞的原发性肿瘤，也是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤。其中，胶质母细胞瘤(GBM)是成人最常见、最具侵袭性的原发性脑肿瘤。GBM具有细胞异质性高，呈弥漫性浸润、高度侵入性、异常血管生成等特点[13]。尽管采用包括手术治疗、放疗和替莫唑胺在内的多模式治疗方法，但GBM患者的预后不良，患者的中位生存期仅为14～17个月,继发性GBM患者的总体5年生存率只有5%[14]。大规模的基因组研究根据癌症基因组图谱推断出了GBM多种突变亚型，包括TP53、PTEN、神经纤维蛋白-1和表皮生长因子受体(EGFR)等。PACAP及其相关受体在人脑胶质瘤中的普遍表达。学者们通过几种胶质瘤细胞体外模型研究了PACAP的功能作用。

2.1PACAP抑制神经胶质瘤增殖、迁移

2.1.1普通条件下PACAP对神经胶质瘤的影响 VERTONGEN等[15]率先报道，PACAP显著降低了T98G人脑胶质瘤细胞的增殖。通过PACAP作用于2种人类GBM细胞系(M059K和M59J细胞)，证明PACAP通过PI3K/Akt信号通路抑制了瘤细胞侵袭、迁移，但是对细胞增殖没有影响[16]。PACAP还可通过阻断PI3K/Akt和Sonic Hedgehog-GLI1(Shh/GLI1)通路抑制GBM的侵袭[17]。PACAP通过VPAC受体系统影响PI3K/Akt信号通路，降低M059K、M059J和U87MG的侵袭、迁移[16]。

2.1.2乏氧微环境下PACAP对神经胶质瘤的影响 GBM由浸润细胞、基质、血管、细胞因子和周围基质组成的异质性肿块，肿瘤快速增长造成的乏氧微环境是包括GBM在内的各种实体瘤的共同特征。GBM和其他实体瘤一样，含有与组织坏死和异常新生血管形成相关的广泛缺氧区域。乏氧微环境还驱动胶质瘤干细胞中低氧诱导因子(HIF)的转录，HIF是由HIF-1α和HIF-1β构成的异二聚体。正常情况下，HIF-1α可在脯氨酸和E3泛素-蛋白连接酶的作用下降解。但是，在氧缺乏的环境下，HIF-1α的降解被抑制，导致其与HIF-1β形成异二聚体，后者通过与多种基因启动子上的缺氧反应元件(HREs)结合，促进靶基因如血管内皮源性生长因子(VEGF)的转录和表达[18]。VEGF一直被认为是促进肿瘤血管生成最重要的生长因子,介导了新生血管的形成。HIF-1α与VEGF协同促进肿瘤血管的新生[19]。mTOR是PI3K/Akt信号通路的下游底物之一，PI3K/Akt/mTOR通路通过调控单核巨噬细胞的活动介导血管新生，mTOR也可以促进VEGF的分泌表达[19-20]。因此，胶质瘤中形成的乏氧微环境导致HIF-1α、VEGF、mTOR的增加，三者相互作用促进了胶质瘤中血管的新生和增加，也与肿瘤细胞迁移和生长侵袭密切相关。PI3K/Akt可负性调节血管生成素2(Ang2)，促进血管生成[21]。乏氧微环境和HIF的激活诱导实体瘤核心区EGFR过度表达。

表皮生长因子(EGF)是1962年COHEN发现的可以与EGFR结合并激活后者。EGFR是跨膜受体酪氨酸激酶ERBB家族的一员，其由3部分组成，包括位于胞外的配体结合域、膜上的跨膜域和胞内酪氨酸激酶域。EGFR通过与细胞外配体结合被激活，随后出现细胞内酪氨酸激酶结构域的磷酸化。EGF/EGFR信号通路在细胞增殖、分化和迁移中发挥重要的调控作用[22-23]，与PACAP及胶质瘤密切相关的，如EGFR/PI3K/Akt信号通路和EGFR/Ras/Raf/MAPK信号通路。有报道指出，GBM中经常观察到EGFR扩增，导致肿瘤的发生和发展，研究发现在数个GBM样本中由于EGFR的高表达，导致PI3K/Akt信号通路的异常激活而影响细胞功能，包括增殖、侵袭、血管生成和抗凋亡。在神经胶质瘤中，Akt的激活被证实可以促进胶质瘤细胞的侵袭、血管生成和迁移[24]。因此，EGF与EGFR表达水平的异常被认为与GBM发展过程密切相关。肿瘤乏氧微环境的作用不仅促进血管生成，同时还促进肿瘤上皮细胞向更恶性的间充质表型转变即上皮-间充质转化(EMT)[25]。EMT是肿瘤转移的关键过程。研究发现，在乏氧环境中，PACAP可以通过抑制PI3Ks-Akt和MAPK/ERK信号通路降低Ser473位点的磷酸化，降低乏氧环境中U87MG细胞中HIF-1α、HIF-2α和EGFR的表达来对抗缺氧介导的GBM细胞迁移[26]。

研究证明，PACAP可以调控低氧环境中的神经母细胞瘤细胞中VEGF及其受体的表达[27]。PACAP也可通过PI3K/Akt和MAPK/ERK途径抑制来降低乏氧环境中U87MG细胞中VEGF的表达和分泌，进而减少新血管的形成。同时，降低了EMT标志物的表达：波形蛋白、基质金属蛋白酶-2(MMP-2)和MMP-9，恢复了闭锁小带蛋白1(ZO-1)的表达水平，抑制了肿瘤细胞的EMT过程[28]，降低了GBM侵袭性。

2.1.3能量缺乏(CR)微环境中PACAP对胶质瘤的影响 不仅乏氧微环境的改变会影响肿瘤细胞的生物活性，与营养不良无关的CR也可以广泛有效地预防癌症[29]。血清剥夺实验证实，CR能降低细胞增殖，增强细胞自噬和DNA修复过程，还可以降低细胞微环境中激素的合成代谢、生长因子和活性氧等多种致癌物质的水平，通过干扰肿瘤细胞之间的相互作用，降低细胞增殖、侵袭和迁移[30]。

神经胶质源性中枢神经系统肿瘤转化的细胞中高表达的巢蛋白(nestin)。GMB中的nestin表达通常高于侵袭性较小的胶质瘤，表明nestin的表达与肿瘤恶性度之间存在相关性。因此，可以通过检测nestin在中枢神经系统中表达水平的增加来判断肿瘤的预后。另一方面，GFAP表达的降低与胶质瘤的生长和恶性程度成反比，此现象在高级别胶质瘤中比在低级别胶质瘤中更为突出。血清剥夺实验研究证实，CR通过显著降低细胞周期蛋白D1和Bcl-2的水平，增加p53和裂解的caspase-3的表达而抑制细胞增殖，而给予PACAP可以通过激活PAC1/VPACR介导的过程，进一步降低CR环境中nestin的表达，增加细胞的凋亡和GFAP的表达，实现降低肿瘤细胞的恶性程度，降低肿瘤细胞增殖的作用[31]。

2.2PACAP促进胶质瘤细胞的增殖 研究证明，在小鼠C6胶质瘤细胞体外培养过程中，PACAP通过PAC1R，提高了瘤细胞内cAMP的浓度，具有促进肿瘤细胞增殖的能力[32]。PACAP-27在1 pmol/L至10 nmol/L浓度范围内对小鼠C6胶质瘤细胞具有显著促增殖能力，且伴剂量依赖性[33]。PACAP-38显著上调人多形性恶性胶质瘤细胞T98G中脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA的表达，使得CREB磷酸化转录机制的激活及随后新的BDNF-转录物产生，于PACAP-38处理72 h后，观察到T98G细胞释放BDNF[34]，BDNF作为细胞因子，具有促进肿瘤细胞增殖的作用。出现相反的结果可能是由于细胞系的来源，PACAP作用的时间、浓度及肿瘤微环境之间的相互影响所致。

3 小 结

PACAP是在体内分布广泛的一种内源性神经肽，具有调控包括神经系统在内的多个系统生理功能的特点。PACAP可以通过包括cAMP/PKA/CREB、PI3K/Akt等多个信号通路调控胶质瘤细胞的增殖、侵袭、迁移。胶质瘤组织的肿瘤细胞来源不明确，细胞组成复杂，加之各种细胞分泌的可溶性细胞因子及细胞外基质及细胞之间的信息交流共同构成胶质瘤微环境。PACAP在不同的肿瘤微环境中发挥的作用各不相同。在乏氧和CR的微环境中具有抑制细胞增殖迁徙的作用，这一发现有望成为抑制胶质瘤恶性增殖、侵袭迁移和血管新生的潜在靶点。但是，这一发现还停留在体外细胞实验阶段，未来有望通过体内试验验证PACAP的作用，以更好地评估其对胶质瘤的作用效果。总之，从分子信号通路出发，通过体内、体外研究深入探索PACAP在肿瘤微环境的相关分子机制，为治疗胶质瘤提供新的方向，为人类肿瘤的治疗提供新的曙光。