自然流产和超声检查提示脏器结构异常胎儿的染色体高通量连接探针扩增技术检测分析

李启发，朱健生，唐俊湘，孙玉秀，李景然，王朝红

安徽省妇幼保健院，安徽医科大学附属妇幼保健院遗传中心，合肥 230000

自然流产指非人为造成、自然状态下发生的流产，发生率为10%～15%［1］。导致自然流产的因素很多，遗传性因素有染色体数目、结构异常等；非遗传性因素有感染、子宫异常、精子DNA碎片化、内分泌或免疫系统紊乱、孕妇患有抗磷脂抗体综合征或易栓症等［2］。尽管病因多样，胚胎染色体异常是导致自然流产的常见原因。研究［3］发现，孕12周之前的流产中至少50%是由胚胎染色体异常导致的，其中染色体数目异常约占86%，染色体结构异常尤其是染色体末端结构异常约占6%。此外，约3%的胎儿会出现超声结构异常，包括单系统微小异常及严重的多系统缺陷。研究［4-5］发现，超声结构异常胎儿染色体异常率为10%～32%。这时，进一步遗传学检测方法明确诊断对后续临床诊疗十分重要。染色体检查可以明确病因，减少孕妇的心理负担，还可以减少其他不必要的检测及治疗［6］。特定的染色体异常提示亲代隐匿性平衡易位的可能性，因此对流产物进行染色体检查有助于后续的遗传咨询。既往临床常用的染色体分析方法有G显带核型分析、荧光原位杂交（FISH）、QF-PCR技术及低深度全基因组测序拷贝数变异分析（CNV-seq）等，均具有检测周期长，检测费用较高等缺点。高通量连接探针扩增技术（HLPA）是由多重连接探针扩增（MLPA）改进而来的一种新检测方法，能够识别染色体末端大于3 Mb以上的缺失重复，具有快速、准确、价格便宜等优势［7］。目前关于HLPA在自然流产和超声异常胎儿染色体检测的应用情况相关研究报道尚不多见。我们观察了HLPA在自然流产或超声检查显示心脏、淋巴水囊瘤或多发畸形等结构异常胎儿染色体检测中的应用效果。现报告如下。

1 资料与方法

1.1 临床资料 采取随机数字表法选取2019年2月—2021年10月于我院就诊的自然流产或超声检查胎儿存在结构异常的1 183例孕妇。1 183例孕妇中自然流产995例、超声胎儿结构异常170例。自然流产患者孕7～15周，平均9周；超声胎儿结构异常者孕12～32周，平均26+2周。1 183例孕妇分为HLPA组372例、对照组811例。HLPA组孕妇年龄21～43岁，平均30.5岁，孕7～28周，平均10.9周；CNV-seq组孕妇年龄20～45岁，平均30.6岁，孕7～32周，平均12.2周；两组年龄、孕周等资料具有可比性。本研究通过安徽省妇幼保健院医学伦理委员会审批，患者及家属均对本实验知情，自愿要求检测签署知情同意书。

1.2 胎儿染色体检测 孕早期孕妇留取绒毛组织约30 mg，孕中晚期孕妇取胎儿肌肉组织约0.5 cm×0.5 cm大小，0.9%生理盐水反复洗涤后-20 ℃冻存。将留取组织标本组织研磨后，采用短串联重复序列（STR）分型方法排除母源性污染、三倍体和单亲二倍体情况。

HLPA组采用HLPA检测胎儿染色体：①DNA提取：提取基因组DNA的浓度和纯度通过紫外分光光度计测定，DNA浓度调整至20～50 ng/μL。②连接反应：取2×连接缓冲液、探针混合液3001、耐热DNA连接酶和样本连接反应15 h。③连接产物多重荧光PCR扩增。④扩增产物荧光毛细管电泳分离：将适量的样品文库与扩增产物稀释液混匀95 ℃5 min变性后，上ABI3500基因分析仪进行测序分析。⑤数据读取及分析：利用GeneMapper®v4.1软件对基因分析仪DataCollection®软件收集的原始数据文件进行质量控制和数据分析。

对照组采用CNV-seq技术检测胎儿染色体：①DNA提取： 45 μL裂解反应液，37 ℃温育10 min；再加入300 μL缓冲液BST1，室温孵育10 min，3 min后弃上清，加入600 μL MKW1，2 min后弃上清，重复2次；加入65 μL缓冲液DH，静置5 min后将EP管短暂离心，静置1 min后吸取63 μL于EP管，-20 ℃冻存。②文库构建：酶切打断后先磁珠纯化，再PCR反应。③文库Pooling测序：将适量的样品文库与质控样品文库等量混合后Illumina NextSeq 550AR高通量测序仪分析。

1.3 统计学方法 采用SPSS23.0统计软件进行数据处理。计数资料比较采用χ2检验。P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

1 183例样本中18例（1.52%）检测失败，最终1 165例纳入研究。HLPA组、对照组胎儿检测失败率分别为1.61%（6/372）、1.48%（12/811），二者比较，χ2=0.03，P＞0.05。HLPA组、对照组胎儿染色体异常检出率分别为60.11%（220/366）、49.94%（399/799），二者比较，χ2=0.524，P＞0.05。HLPA组中胚胎染色体异常220例（60.11%），其中染色体数目异常204例（55.74%）、染色体结构异常16例（4.37%），染色体结构异常中≥10 Mb缺失重复12例（3.28%），3～10 Mb缺失重复3例（0.82%）、≤3 Mb缺失重复1例（0.27%）。对照组胚胎染色体异常399例（49.94%），其中染色体数目异常369例（46.18%）、染色体结构异常30例（3.75%），染色体结构异常中≥10 Mb缺失重复20例（2.5%）、3～10 Mb缺失重复 4例（0.5%）、≤3 Mb缺失重复 6例（0.75%）。 HLPA组、对照组胎儿染色体数目异常率、染色体结构异常情况，差异均无统计学意义（χ2分别为0.455、0.565、0.428、0.959；P均＞0.05）。

3 讨论

自然流产是指非人为目的造成的流产，是由于自然因素导致的流产。至少50%的孕12周前自然流产是由胚胎染色体异常引起，且多为染色体数目异常，包括非整倍体和多倍体［3］。YAKUT 等［7-8］对457例流产组织进行分析显示三体型最多，频率较高的是16、21、18、13、22和X 染色体。本研究中1 165例胎儿中染色体异常率为53.13%（619/1 165），其中非整倍体异常483例（41.46%）、三倍体异常88例（7.55%），单亲二倍体2例（0.17%）、染色体结构异常46例（3.95%，其中缺失或重复28例、合并缺失重复18例）。本研究非整倍体异常中三体型异常占比最高（34.34%，400/1 165），三体型异常中16染色体三体最常见，其次为22、21、13、15和18三体；单体型染色体7.12%（83/1 165），为X染色体单体（80例），3例常染色体单体均为21单体。提示胚胎染色体异常不但主要表现为非整倍体形式，而且非整倍体的类型也较为集中。但本研究中没有发现19号染色体异常的胎儿。19号染色体58.6 Mb，包含1 473个蛋白质编码基因、918个非编码基因和527个假基因，基因密度最高.如存在异常，流产会在妊娠的第3、4周甚至更早发生，患者可能只视为月经紊乱［9］。

目前流产表型与特定遗传物质异常相关联的关系仍不明确。本研究发现，自然流产发生在孕7～15周，平均9周，其中染色体数目异常531例，染色体结构异常者41例，异常类型包括单条、多条染色体数目异常、三倍体、单亲二倍体、部分缺失重复等多种情况，且异常情况分布于每条染色体。超声胎儿结构异常的胎儿中染色体数目异常40例、染色体结构异常者5例，异常类型仅为单条染色体数目异常和染色体的部分缺失重复，数目异常的染色体号也比较集中，仅分布在9、13、18、21和X染色体上，18三体发生率最高，其次为X单体、13、21三体。除13、18、21和X染色体，其他染色体数目异常大多是致死性的，通常会发生孕早期胚胎停育［10］，如流产组织中最常见的16三体染色体异常，发生率为1%～2%，但16三体染色体异常致死性较高，本研究中16三体染色体异常仅见于自然流产。21三体活产儿发生率为1/600～1/800，但产前超声多无明显异常，产前难以检出，其分娩风险最高；18三体染色体异常的活产儿发生率低于21三体染色体异常，多数产前超声都会发现胎儿存在一种或几种异常［11］。

流产组织染色体分析有助于明确流产原因［3］。G显带核型分析结果是染色体分析的临床金标准，但费时费力、实验周期长、分辨率低且存在培养失败的风险［12］。FISH或QF-PCR技术具有检测周期短、价格低等优点，但分辨率低，检测范围局限［13］。CNV-seq技术既可以检测染色体数目异常又可以检测亚显微水平的拷贝数变异，具有高分辨率、高准确性和高基因覆盖率等优势，但费用高、耗时长［14］。HLPA是由多重连接探针扩增（MLPA）改进而来的一种新方法，在近端粒区域增加了足够的探针，能够可靠的识别染色体末端大于3Mb以上的缺失重复，且具有快速、准确、价格便宜等优势［15］。虽然CNV-seq分辨率高达100 Kb，能更好地检出微小拷贝数变异，但本研究为流产组织，≥3 Mb染色体异常占比高达98.87%，且一般认为CNV＞10 Mb与自然流产直接相关，10 Mb＞CNV＞2 Mb则需要参考CNV数据库［16］。人类基因组中虽有许多小片段CNV，但这些是进化、遗传多样性和疾病易感性的基础，目前尚不确定是否与流产有关，致病性小片段CNV的发生率仅为0.6%～0.78%，意义不明的小片段CNV给后续诊断病因及遗传咨询带来了极大挑战。HLPA是一种准确、经济、快速的检测流产组织染色体的方法［17］，具有高灵敏度（98.9%）和高特异度（100%）。本研究中。两种检测技术对于染色体数目异常和部分缺失重复，检出率相当，差异无统计学意义。因此，HLPA在孕早期流产病因诊断中有很好的应用前景，有助于后续遗传咨询。

临床应用中，HLPA检测每例样本所需费用1 200元，检出1例染色体异常胎儿的平均费用1 996.4元；CNV-seq检测每例样本所需费用2 000元，检出1例染色体异常胎儿的平均费用4 005.0元。HLPA的检测费用低于CNV-seq技术，可缓解患者的经济压力。

综上所述，HLPA对染色体异常的诊断效能与CNV-seq技术相当，且检测周期短、成本较低，可用于胎儿遗传学诊断中。