肠杆菌肽对鸡源大肠杆菌和沙门氏菌抑菌作用

马全朝，鲁绍芳，刘英丽，刘 涛，金银利

（ 信阳农林学院，河南 信阳 464000 ）

在养殖业中，随着畜禽疾病治疗或预防性抗菌药物的广泛使用，多重耐药性病原体数量日趋增加，给畜牧经济发展带来巨大隐患。而抗生素研发成本高，新抗生素开发速度远不及新耐药细菌出现速度，难以解决动物疾病防控问题[1-2]。此外，动物源食品中的兽药残留已逐渐成为全世界关注的焦点，开发绿色安全有效无残留的动物药物成为行业课题[3-4]。抗菌肽是原核和真核细胞产生的天然化合物，是大多数生物体针对病原体的自然免疫防御机制重要组成部分，具有替代抗生素的潜力[5]。抗菌肽具有分子量小、水溶性好、热稳定性较高、生物功能多样性、杀菌作用机制独特等特点，不易产生耐药性[6]。抗菌肽在医药卫生、畜牧养殖、食品加工及农业等领域具有广阔的应用前景[7]。目前已发现的抗菌肽有几千种，其中肠杆菌肽是针对肠杆菌属细菌抑菌效果比较优良的一种[8]。

肠杆菌肽是一种小分子抗菌肽[9]，最早由美国普林斯顿大学分离自肠道细菌，是一类分子量小于2.5 kD、具有索套状结构的抗菌多肽，对大肠杆菌、沙门氏菌以及志贺氏菌等肠道菌具有良好抑菌作用。肠杆菌肽结构稳定，对酸、碱、温度均具有很好的耐受性，作为一种天然替抗药物，高效安全、来源广泛，且不易使细菌产生耐药性，已应用于畜牧养殖领域[10-11]。本试验探讨肠杆菌肽对常见肠道致病菌大肠杆菌和沙门氏菌的抑菌作用，并研究肠杆菌肽与临床常用肠道性药物硫酸粘杆菌素联合抑菌作用，旨在为肠杆菌肽替代抗生素应用于生产提供参考。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

大肠杆菌、沙门氏菌均分离自河南省信阳市养鸡场；大肠杆菌编号为E1、E2、E3、E4、E5，沙门氏菌编号为S1、S2、S3、S4、S5。质控菌为大肠杆菌ATCC25922。

1.1.2 试验试剂

肠杆菌肽（含量为92.5%），购自林州中农颖泰生物肽有限公司；硫酸粘杆菌素标准品，购自中国药品生物制品检定所。营养肉汤、营养琼脂，购自北京奥博星生物科技有限公司。

1.1.3 试验仪器

高压蒸汽灭菌锅购自上海博迅实业有限公司医疗设备厂，电子天平购自宁波金诺天平仪器有限公司，酶标仪购自山东方科仪器有限公司，VS-1300洁净工作台购自苏洁医疗器械苏州有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 标准液配置

称取肠杆菌肽样品0.027 6 g，置于25 mL容量瓶中，采用蒸馏水定容到刻度，得到1 024 mg/L标准溶液。硫酸粘杆菌素标准液的配制方法同上。

1.2.2 药敏纸片法试验

1.2.2.1 肠杆菌肽药敏片制备

用打孔器将定性滤纸制成6 mm 的纸片，置于高压蒸汽灭菌锅中121 ℃ 30 min 灭菌。将肠杆菌肽标准溶液倍比稀释，得到256、128、64、32、16、8、4 mg/L系列浓度溶液。

将灭菌后的滤纸片浸泡在肠杆菌肽系列溶液中，边浸泡边摇晃均匀，使药液被滤纸片充分吸收。使用镊子将滤纸片依次分开摆放，置于平皿中，并于40 ℃烘箱中干燥。干燥后的药敏片放入密封深色玻璃瓶内，-20 ℃保存。

1.2.2.2 抑菌作用

使用生理盐水将细菌制成菌悬液，麦氏比浊管调整菌液的浊度为0.5 麦氏单位，调整菌悬液浓度约为1×106CFU/mL。取0.3 mL上述菌悬液，用涂布棒在营养琼脂平板上涂抹均匀，盖好平皿盖，室温静置5 min。用消毒后的镊子在无菌环境下将制作好的药敏片分别均匀贴在接种大肠杆菌、沙门氏菌营养琼脂平板上，贴放好后，用无菌镊子轻压，使其紧贴于平板表面。盖好平皿盖，放在37 ℃恒温培养箱中培养24 h，用游标卡尺测量抑菌圈的直径。

1.2.3 最小抑菌浓度（MIC）

在96 板中加入100 μL 的营养肉汤，在第一孔中加入药物标准液，在1～10 列中依次倍比稀释；第11 列不加药物，作为阳性对照；第12列只加入培养基，作为阴性对照。得到药物浓度为512、256、128、64、32、16、8、4、2、1 mg/L系列浓度溶液，每孔加入等体积的指示菌，终浓度约为1×106CFU/mL，同样方法进行3 个重复试验，将加好样品的96孔板放入恒温培养箱37 ℃培养24 h。

1.2.4 联合抑菌作用

采用棋盘微量稀释法测定肠杆菌肽与硫酸粘杆菌素联合抑菌指数（FIC）。在96 孔板上分横向（由左向右8 排孔）和纵向（由上向下8排孔）各加两种药物的倍比稀释药液50 μL，在64 个孔里两种药物形成不同的联合用药浓度，从第1孔至第64孔浓度逐渐降低。第9孔加入100 μL营养肉汤培养基作为生长对照，第10 孔加入200 μL 营养肉汤培养基作为空白对照。之后加入1.0×106CFU/mL的菌悬液，37 ℃培养24 h。每组试验做3次重复。

判定标准：FIC≤0.5 表示协同作用；0.5～1 表示相加作用；1～2表示无关作用；＞2表示拮抗作用。

1.2.5 抑菌曲线

分别选择1 株细菌，测定肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌抑菌曲线。选用2MIC、1MIC 和1/2MIC 浓度的肠杆菌肽溶液，采用96 孔板分别测定肠杆菌肽浓度在2MIC、1MIC 和1/2MIC 时对大肠杆菌、沙门氏菌的抑菌效果，设置不加肠杆菌肽的细菌生长组为对照组。

将做好的96 孔板放在酶标仪中，在600 nm 波长处测定菌液吸光度（OD 值），记录从0～24 h 各个时间段的OD值，每隔2 h检测一次，每次测定3次求取平均值。将所测得的OD 值与其相应的培养时间作图，以时间为横坐标，OD值为纵坐标，绘制相应的抑菌曲线。

2 结果与分析

2.1 纸片法药敏试验结果（见图1、图2）

图1 肠杆菌肽对大肠杆菌抑菌作用Fig.1 Antibacterial effect of enterobacterin against E. coli

由图1、图2可知，在低浓度时肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌即可表现良好的抑菌作用，在4～64 mg/L范围内，随着药物浓度增加，抑菌圈直径快速增大，抑菌作用迅速增强。在64～256 mg/L范围内，随着浓度增加，抑菌圈直径增加比较缓慢，抑菌作用未呈现明显增强。肠杆菌肽对大肠杆菌的抑菌圈直径在6.0～21.6 mm，对沙门氏菌抑菌圈直径在6.0～22.5 mm。浓度达到128 mg/L 以上时，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌呈中度敏感。

图2 肠杆菌肽对沙门氏菌抑菌作用Fig.2 Antibacterial effect of enterobacterin against Salmonella

2.2 肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC（见表1）

由表1可知，肠杆菌肽对大肠杆菌MIC在4～8 mg/L之间，对沙门氏菌的MIC在4～16 mg/L之间。

表1 肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的MICTab.1 MIC of enterobacterin against E.coli and Salmonella单位：mg/L

2.3 肠杆菌肽和硫酸粘杆菌素对大肠杆菌、沙门氏菌的联合抑菌作用（见表2、表3）

由表2、表3可知，肠杆菌肽和硫酸粘杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌联合应用药敏试验的FIC 指数在1.0～1.5 之间，均表现为无相关作用。

表2 肠杆菌肽和硫酸粘杆菌素对大肠杆菌联合抑菌作用Tab.2 Combined effect of enterobacterin and colistin sulfate against E.coli

表3 肠杆菌肽和硫酸粘杆菌素对沙门氏菌联合抑菌作用Tab.3 Combined effect of enterobacterin and colistin sulfate against Salmonella

结果表明，肠杆菌肽与硫酸粘杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌无联合抑菌效应，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌的MIC低于硫酸粘杆菌素。因此，肠杆菌肽抑菌效果优于硫酸粘杆菌素。

2.4 抑菌曲线

试验通过测定细菌生长菌液的OD 值，探讨不同作用时间、不同作用浓度下，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌生长的抑制作用，抑菌曲线见图3、图4。

由图3、图4 可知，在2MIC 和1MIC 浓度下，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌均具有良好抑菌作用，能够完全抑制细菌的增殖。当浓度为1/2MIC 时，与正常生长细菌相比，肠杆菌肽具有一定抑制细菌增殖作用，表明大肠杆菌和沙门氏菌直接暴露于低于MIC的肠杆菌肽时，细菌生长仍可受到一定程度抑制。

图3 肠杆菌肽对大肠杆菌生长抑制作用Fig.3 Effect of enterobacterin on growth of E.coli

图4 肠杆菌肽对沙门氏菌生长抑制作用Fig.4 Effect of enterobacterin on growth of Salmonella

3 讨论

肠杆菌肽是一种对动物肠道病原菌具有良好抑制作用的抗菌肽，在饲料添加剂和动物预防保健方面均有应用。肠杆菌肽抑菌作用机制主要有两种：肠杆菌肽能够与RNA聚合酶次级通道的结合，阻碍核苷酸进入酶的活性位点，从而抑制mRNA的形成和蛋白质的合成。肠杆菌肽还能够破坏细胞膜增加膜的通透性，导致细胞内物质外泄，致使病原菌死亡[12-13]。肠杆菌肽主要应用于动物肠道疾病的预防和治疗，如肠炎、腹泻等[14]。探讨肠杆菌肽对主要肠道致病菌大肠杆菌和沙门氏菌具有重要的意义。作为评价抗菌物质的重要指标，MIC、抑菌圈直径能够客观地反映其体外抗菌效果，联合抑菌作用能够反映药物的配伍特性，从而为进一步的临床应用试验提供方案。

抑菌试验结果表明，肠杆菌肽对大肠杆菌和沙门氏菌具有良好的抑菌效果，MIC 均达到4 mg/L，达到或超过一些常用抗生素的效果。纸片药敏试验结果显示，在4～64 mg/L 浓度时，肠杆菌肽的抑菌效果随着浓度增加而增加；当抑菌浓度达到128 mg/L 以上时，药物的抑菌效果基本达到饱和，随着浓度增加，到256 mg/L 时抑菌作用趋于稳定。因此，在临床应用肠杆菌肽时要设定合理的给药浓度，增加药物浓度并不能够大幅度提高药物效果。

硫酸粘杆菌素作为饲料添加剂和肠道疾病防治药物广泛应用于养殖业中[15]。但随着禁止在饲料中添加硫酸粘杆菌素，寻找绿色的替代产品成为研究的方向。试验表明，肠杆菌肽在降低料重比、腹泻率和提高日增重等方面具有良好的作用[16-17]。本研究中，由两种药物抑菌MIC可知，肠杆菌肽的抑菌作用优于硫酸粘杆菌素。

目前仍然缺乏肠杆菌肽的临床应用数据，本试验探讨了肠杆菌肽与硫酸粘杆菌素的联合抑菌作用，试验结果表明，两者对大肠杆菌和沙门氏菌的无联合抑菌效果。研究肠杆菌肽与其他抗生素联合使用效果也能够为减少抗生素使用提供新的方案，但仍需要广泛探讨。

4 结论

本研究结果表明，肠杆菌肽对鸡源大肠杆菌和沙门氏菌具有良好的抑菌作用，MIC 可达4 mg/L；药物浓度达到128 mg/L 以上时，抑菌作用处于中敏以上；与硫酸粘杆菌素对大肠杆菌和沙门氏菌无联合抑菌作用。