一种复合香型白酒糟醅微生物多样性研究

薛江林，杨贵，张宿义，范宏筠，张煜亮，梅海，母娟，杨明永，杜鑫，王程

(1.泸州国宝天酿集团股份有限公司，四川泸州 646000；2.泸州老窖股份有限公司，四川泸州 646000；3.四川轻化工大学生物工程学院，四川宜宾 644000)

中国白酒由最初的浓香、酱香、清香3 种基本香型发展到如今的十三大香型[1]，逐渐转向多种香型组合发展的方向。20 世纪90 年代末，各大酒企就提倡“浓香为主、多香并举”的生产发展战略[2]，以顺应社会快节奏、多社交、多频次等的消费需求[3]。目前针对白酒酿造工艺融合的研究，在国外研究较少，国内对于提高浓香型白酒出酒率及酒质的研究一直是行业内研究的重点，但在白酒酿造工艺融合的研究方面行业内一直在探索前进[4-6]。因此，本实验在传统泸型酒酿酒工艺基础上借鉴学习浓香型、酱香型、清香型白酒的酿造工艺，创新设计出一套特殊的白酒酿造工艺。通过分析不同工艺配料发酵过程的理化、风味、微生物以及白酒品质之间的关系不断优化调味酒酿造工艺；由多轮次试验得到三组较优的试验方案，通过高通量测序技术对3 种试验方案的堆积前、入窖、出窖的糟醅微生物多样性、代谢途径进行分析研究；结合糟醅理化性质，以及最终酒质的感官尝评结果，确定出最优的工艺条件参数。本实验为中国白酒调味酒种类的丰富提供了一定参考，也对不同香型白酒的生产技术做出了一定的归纳总结。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

材料：糯红高粱，四川联众供应链服务有限公司；谷壳，泸州市龙马潭区永福米厂；高温大曲，泸州市醇香生物制造有限公司；河内白曲，山东梁山徐坊大曲有限公司；糖化曲，安琪酵母股份有限公司。试验地点选在泸州某酒厂生产车间。

试剂及耗材：氢氧化钠、葡萄糖、盐酸、氯化钠、无水乙醇、五水硫酸铜、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠，分析纯，；2-辛醇，色谱纯，Sigma-Aldrich；购自聚合化工。

仪器设备：TL2010S 中通量组织研磨仪，北京鼎昊源科技有限公司；SP-756P 紫外可见分光光度计，上海屹谱仪器有限公司；MLS-375L 全自动灭菌锅，日本日立公司；DHG-9245A 烘箱，上海一恒科学仪器有限公司；DL-1 电炉，北京中兴伟业仪器有限公司；5804R 高速冷冻离心机，德国艾本德公司。

1.2 试验方法

1.2.1 工艺流程图

图1 工艺流程图

1.2.2 实验设计

1.2.3 取样

每个方案同时做3 口一样大小（3.2 m×2.4 m×1.8 m）的平行窖池，取堆积前、入窖、出窖三个时间点的样品，将统一方案的3 口窖池所采样品置于无菌取样袋中立即密封混合均匀，再将其分为2份，1份保存在-20 ℃用于理化特性检测，1 份保存在-80 ℃用于基因组DNA提取。

1.2.4 理化指标检测

理化指标检测参照书目《白酒分析与检测技术》和《白酒生产技术全书》中的步骤[7-8]。

1.2.5 DNA提取方法

称取10 g 糟样，用SDS[9]提取糟醅样品中微生物的基因组DNA。基因组DNA 送往上海美吉生物医药科技有限公司进行高通量测序，测序数据在美吉生物云平台(https:l/lcloud.majorbio.com/)进行处理。

1.2.6 基酒感官尝评方法

基酒感官品评方法参考国标GB/T 33404—2016[10]、GB/T 33405—2016[11]。

1.2.7 数据分析利用SPSS 进行数据差异性检验分析，根据高通量扩增子测序数据，利用PICRUSt2(v2.2.0-b)对标记基因（16S/ITS）序列进行功能丰度预测，获得每个样本中对应的功能信息和丰度信息，并采用origin2018以及R语言进行绘图。

2 结果与分析

2.1 理化指标分析

不同方案堆积、入窖、出窖糟醅水分、酸度、还原糖、淀粉含量如图2 所示。糟醅水分含量为52.6%～59.5%，发酵过程中每个方案的水分都呈现先降低后增加的趋势，变化差异显著，加麸皮在堆积过程中对水分消耗相对较大。3个方案的酸度变化差异显著，加麸皮能够增加溶氧，在堆积过程中酸能够快速被微生物代谢分解，在发酵过程中又能显著增加。从图2 可以看出，方案1 和方案3 堆积和发酵前后酸度变化差异最大，方案1 堆积前酸度最大，堆积后降为最小，发酵结束后又升至最大，方案2 在堆积和发酵前后酸度变化差异最小。3 种方案的还原糖和淀粉含量变化趋势基本一致，差异不明显，在堆积前后，方案2 还原糖含量增加相对大于方案1 和方案2，发酵前后，方案3 中淀粉含量消耗最大，方案1和方案2次之。

图2 3种方案理化指标

2.2 微生物群落结构分析

2.2.1 糟醅微生物多样性分析

对3 个不同方案糟醅样品的ASV（Amplicon Sequence Variant）集、Chao1 指数和Shannon 指数进行比较分析（表2），可以看出，Chao1 和Shannon 指数都呈现先减少后增加的趋势，方案1 和方案3 中细菌堆积前后丰富度变化巨大，表明加入麸皮能够极大地降低细菌的多样性，对真菌却影响不显著；方案2 整体变化相对较小；真菌堆积前后丰富度变化并不明显，在发酵过程中增加。

表2 不同方案的原核和真核微生物菌群多样性指数

2.2.2 不同方案糟醅细菌群落结构对比分析

糟醅原核微生物群落组成（＜1 %合并为Others)如图3 所示，不同方案中共检出18 种优势细菌，细菌种类组成相似，丰度存在差异。从整体上来看，3 种方案在堆积和发酵结束时，入窖和出窖糟醅的细菌结构相似，优势微生物分别为醋酸杆菌属（Acetobacter）和乳酸杆菌属（Lactobacillus），丰度超过90 %；不同点更多在于堆积过程，通过对比D1、D2 和D3，不难发现，D1 和D3 的细菌结构具有相似性，可能是由于都加有麸皮所导致，差别在于D3 中克罗彭斯特菌属(Kroppenstedtia)丰度显著高于D1；相较于D1 和D3，D2中Lactobacillus和芽孢杆菌属（Bacillus）的丰度更小，糖多孢菌属（Saccha-ropolyspora）和Solitalea的丰度更大。对比R1、R2和R3，在堆积过程中加麸皮能够显著增加疏松度，使得溶氧增加，好氧微生物的丰度显著大于不加麸皮；在C3 中还存在一定量的Acetobacter，表明在方案3 的整个发酵过程中，Acetobacter因麸皮的增氧属性，一直参与整个酿造过程。从配料差异分析，河内白曲和糖化曲在堆积前后对细菌群落结构的影响较小，麸皮影响较大。

图3 不同方案堆积、入窖和出窖糟醅细菌群落结构

2.2.3 不同方案糟醅真菌群落结构对比分析

糟醅真核微生物群落组成（＜1 %合并为Others)如图4 所示，不同方案中共检出22 种优势真菌，且真菌种类和丰度都存在显著差异。对比发现，在堆积前，方案1 的真菌优势微生物为嗜热真菌属（Thermomyces89 %），方案2为Thermomyces13 %和曲霉属（Aspergillus76 %），方案3 为丝衣霉属（Byssochlamys12 %）、Thermomyces31 %、Aspergil-lus16%、嗜热子囊菌属（Thermoascus30%）。堆积后，方案1 中优势微生物以酵母属为主，包括伊萨酵母属（Issatchenkia29 %）、毕赤酵母属（Pichia29 %）以及哈萨克斯坦酵母（Kazachstania25 %）；方案2 优势微生物以Byssochlamys98%为主；方案3 优势真菌微生物为Byssochlamys87 %和Issatchenkia10 %。出窖后，方案1 优势微生物群落结构复杂，包括Byssochlamys8.8 %、Thermomyces2.6 %、Aspergillus7.9 %、Issatchenkia27 %、Pichia 15%、青霉菌属（Penicillium4.2%）、节担菌属（Wallemia7.4 %）、Thermoascus3.1 %；方案2 真菌微生物种类呈多元化，其中优势微生物为Byssochlamys2.7 %、Thermomyces2.4 %、Aspergillus6.9 %、Issatchenkia9 %、Penicillium9.5 %、Pichia4.7 %、Wallemia23 %；方案3 优势微生物包括Byssochlamys14%、Aspergillus6%和Penicillium52%。

图4 不同方案堆积、入窖和出窖糟醅真菌群落结构

对比3 种方案，从微生物的种类、多样性和丰度进行讨论，在堆积前期，不同种曲药使优势真菌微生物群落结构差异巨大；堆积过后，方案1 的优势微生物主要集中在酵母属，方案2 和方案3 的优势微生物主要集中在霉菌属；发酵结束后，各方案中真菌微生物种类基本一致，丰度各有不同。可见，不同种曲药对整个发酵过程微生物群落结构的影响要远大于辅料对白酒酿造的影响。值得注意的是，优势微生物Thermomyces能够产纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、β-葡聚糖酶和脂肪酶等酶类，为酵母的生长提供了重要动力，同时还能产生蛋白酶，为美拉德反应提供物质基础，故该菌在白酒酿造过程中有着重要的作用[12-13]；Aspergillus能够合成纤维素酶、淀粉酶、蛋白酶、酯化酶、果胶酶，还能合成有机酸[14-15]，这可能是方案2 在堆积过程中酸度降幅最小以及在堆积结束时Byssochlamys成为优势微生物的原因之一。

2.3 微生物代谢通路及主要代谢功能分析

通过图5 分析可见，代谢通路占比最大，3 个方案之间差异较大，方案1 和方案3 呈现先增加后减少的趋势，方案2 呈现持续减少的趋势。具体通过图6 可以看出，在方案1、方案2 以及方案3 的代谢功能丰度对比中，可以明显看出，方案2 要大于方案1 和方案3。在氨基酸、辅酶和无机离子代谢中，堆积后方案1 和方案3 丰度显著增加，在发酵阶段显著降低，方案2 呈减小趋势，表明加入麸皮确实能够在堆积阶段显著增加氨基酸、辅酶以及无机离子的代谢。然而通过对比发现，方案1 和方案3 在堆积过程中氨基酸、辅酶以及无机离子的COG 代谢丰度相较于方案2 更小，表明加入麸皮，糟醅中空隙增加的同时也使得细菌微生物的平均丰度降低，从而在堆积前COG 代谢功能丰度降低，进一步表明方案2 对含氮类物质的代谢消耗更多。在碳水化合物的代谢中，方案1 和方案3 在堆积前后变化不大，在发酵过程中，逐渐增加；方案2 随着酿造时间的增加，碳水化合物的代谢途径呈现先减小后增加的趋势,表明方案1 和方案3 中的细菌微生物对淀粉、糖等物质的消耗速度一直在增加，方案2在堆积过程中细菌微生物对淀粉、糖等物质的消耗速度逐渐降低，在发酵过程中逐渐增加，堆积前的代谢丰度却大于方案1 和方案3。结合图2 可以看出，在入窖和出窖糟醅中，3 种方案的优势细菌微生物都是Acetobacter和Lactobacillus，且丰度相差比不显著，说明3 种方案发酵过程中细菌微生物对淀粉、糖等的消耗速度基本一致，在堆积前后存在较大差异。

图5 各方案堆积和发酵前后细菌微生物群落KEGG通路分布

图6 各方案堆积和发酵前后细菌微生物群落主要COG代谢功能分布

2.4 基础酒感官尝评结果分析

组织专家对三个试验方案三个轮次共九个综合酒样进行感官品评,对每个试验方案的三个酒样分数进行综合平均排序，专家组由4 名酿酒专家和6 名品酒专家组成，白酒感官品评严格按照国家标准GB/T 33404—2016 进行，评分细则主要包括：色泽（5分）、香气（25分）、口感（60分）、风格（10分）四个方面。专家组给出的综合平均结果如表3所示。

表3 基础酒综合样对比品评记录表

对评价结果绘制风味雷达图如图7所示。

图7 基酒感官评价雷达图

结合基础酒的品评结果及图7 可以分析总结出，经过高温堆积、入窖发酵、量质摘酒、长期储存等酿酒工艺后，所酿基础酒在色泽、香气、口感、风格等方面融合了浓香型、酱香型白酒风格之长，特点突出、复合优雅。三实验方案三个轮次共9 个酒样的酒体皆表现为无色或微黄透明、复合感强、风格独特，特别是方案F1（高温大曲+糖化曲）放置一年以后的基础酒酒体颜色明显微黄，醇厚绵甜、丰满协调、具有非常舒适优雅的复合香气。

3 结论

通过对酿造过程中微生物多样性、代谢通路以及基酒的感官品评，发现不同方案之间差异巨大。方案2（高温大曲+糖化曲）的评价结果优于方案1（高温大曲+河内白曲+麸皮）和方案3（高温大曲+糖化曲+麸皮）。通过多轮次实验，最终确定方案2更适用于特殊香型白酒的酿造。通过研究不同香型的工艺融合，分析不同工艺配料发酵过程的理化、风味、微生物以及白酒品质之间的关系来不断优化调味酒酿造工艺，为丰富中国白酒调味酒种类，创新传统中国白酒的生产工艺以及满足消费者多元化需求奠定了坚实基础。