HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测在宫颈病变筛查中的应用价值

刘红丽 刘智荣 赵淑芳 吴楠★

宫颈癌是妇科最常见的恶性肿瘤之一，由于疾病复发和晚期诊断，使其成为全球妇科癌症相关死亡的主要因素［1］。最新统计数据显示，2007～2016年间侵袭性宫颈癌相关死亡人数约34.2 万/年，50岁以上患者死亡率呈逐年下降趋势（每年下降约1%），但50 岁以下患者死亡率未出现明显变化［2］。我国近年来宫颈癌的发病率和死亡率亦呈现上升趋势［3］。根据2022年“中国国家癌症中心”的统计数据显示，我国宫颈癌的发病率约17.69/10 万，死亡率达3.36/10 万［4］。人类乳头瘤病毒（Human Papilloma Virus，HPV）感染是宫颈癌发生的主要诱因［5］，HPV-DNA检测联合宫颈液基细胞学检测（Thinprep Cytologic Test，TCT）成为目前宫颈病变筛查较为常用的手段。HPV 编码基因包括两个区，即早期区（E1、E2、E4、E5、E6、E7、E8）基因和晚期区（L1和L2），其中L1序列相对保守，是目前HPV-DNA检测产品的主要检测靶点，但在宫颈病变由低级别发展成为癌的过程中，L1序列可能会丢失，从而导致漏诊事件的发生［6］。由E6和E7编码的蛋白在宫颈上皮癌变中扮演重要角色，其主要通过抑制p53 和Rb（两种抑癌蛋白）的功能而发挥作用。因此，HPV-E6/E7-mRNA 的过表达是提示细胞发生高级别病变的重要信号，其与“宫颈病变”的相关性相较于HPV-DNA 更强［7］。本研究旨在进一步评估两种指标在宫颈病变筛查中的应用价值，为我国宫颈癌的防治工作提供参考和依据。

1 资料和方法

1.1 一般资料

选取2019年10月至2021年12月于蚌埠医学院第一附属医院行宫颈病变筛查的1 637 例患者作为研究对象，年龄（42.8±10.3）岁，纳入标准：①进行TCT、HPV-DNA、HPV-E6/E7-mRNA 三项检测②既往无宫颈手术史。排除标准：妊娠期女性。所有研究对象均对本研究知情同意，本研究经院医学研究伦理委员会批准。

1.2 TCT 检测

采用广州安必平公司提供的专用宫颈刷置于宫颈口，顺时针旋转4～6 周以获取足量细胞，将采集的样本放置于专用固定液中，依次行震荡30 s、4 200 r/min（离心半径15 cm）离心5 min、弃上清，获取细胞沉淀物，加入适合缓冲液后置于漩涡混合器上震荡30 秒，制成细胞悬液，通过自动制片机行沉降式制片、晾干、染色，由病理医师进行阅片。依据TBS（The Bethesda System）分类标准，诊断结果分为：正常或炎性病变（Negative for Intraepithelial Lesion or Malignancy，NILM），不明意义的非典型鳞状上皮细胞（Atypical Squamous Cells of Undetermined Significance，ASC-US），鳞状上皮内低度病变（Low-grade Squamous Intraepithelial Lesion，LSIL），不排除高度上皮内病变的非典型鳞状上皮细胞（Atypical Squamous Cells，cannot exclude HSIL，ASC-H），鳞状上皮内高度病变（High-grade Squamous Intraepithelial Lesion，HSIL），鳞状细胞癌（Squamous Cell Carcinoma，SCC）等类型。

1.3 HPV-E6/E7-mRNA 表达检测

采用郑州科蒂亚公司提供的HPV-E6/E7-mRNA检测试剂盒和分支链DNA 信号扩增技术，经过杂交捕获，信号放大，冷光仪检测等，依据光信号强弱判定宫颈分泌物及上皮细胞样本中是否存在HPV-E6/E7-mRNA 过表达。

1.4 HPV-DNA检测

采用广州安必平公司提供的HPV-DNA检测试剂盒和PCR-反向点杂交技术，经核酸提取，PCR扩增，杂交和显色等，行宫颈分泌物及上皮细胞样本中HPV-DNA 28 型检测，检测结果可分为高危型（16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68、73、82 型），疑似高危型（26、53、66 型）和低危型（6、11、40、42、43、44、54、61、81、83 型）三种类型。

1.5 统计学处理

采用SPSS 13.0 软件进行分析。计量资料以（）表示；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验。以细胞病理学检查结果为标准，计算不同检验方法的敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同年龄段宫颈病变者中HPV-E6/E7-mRNA、HPV-DNA检测结果分析

各年龄组HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率均有高于HPV-DNA 的趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。随年龄的增加，HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率和HPV-DNA 阳性检出率呈现先升高后降低的趋势。见表1。

表1 各年龄段宫颈病变者HPV-E6/E7-mRNA、HPV-DNA检测结果比较［n（%）］Table 1 Comparison of HPV-E6/E7 mRNA and HPV-DNA Detection Results of Cervical Lesions in Different Ages［n（%）］

2.2 宫颈病变级别与HPV-E6/E7-mRNA、HPVDNA 阳性检出率的相关性分析

NILM 组HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率显著低于HPV-DNA，差异有统计学意义（P<0.05），其余各组中HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率相对于HPV-DNA 均有增高趋势，差异无统计学意义（P>0.05）。见表2。

表2 宫颈病变级别与HPV-E6/E7-mRNA、HPV-DNA 阳性检出率的相关性分析［n（%）］Table 2 Correlation analysis of the cervical lesion grade and the positive detection rate of HPV-E6/E7-mRNA and HPV-DNA［n（%）］

2.3 HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测对宫颈病变诊断参考价值的比较

HPV-E6/E7-mRNA检测的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值、总体符合率显著高于HPVDNA，差异有统计学意义（P均＜0.05）；HPV-E6/E7-mRNA检测的漏诊率和误诊率显著低于HPV DNA，差异有统计学意义（P均＜0.05）。见表3。

表3 HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测对宫颈病变诊断参考价值的比较Table 3 Comparison of the reference values of the HPV-E6/E7-mRNA and HPV-DNA tests for the diagnosis of cervical lesions

3 讨论

HPV 感染与宫颈癌的发生、发展密切相关，因此，HPV 感染检测亦成为宫颈癌筛查的主要手段［8］。目前HPV 种类已鉴定出100 余种，依据致癌能力不同，分为低危和高危两种类型，其中高危型HPV（尤其是HPV-16、18 型）的持续感染是诱导宫颈癌发生的主要原因［9］。尽管HPV-DNA-L1 片段检测有助于诊断HPV 感染，但其感染后的致癌性却难以判断。基于HPV-E6/E7片段在宫颈细胞癌变中的关键作用及其在整合细胞内的持续存在，相对于HPV-DNA检测，HPV-E6/E7-mRNA 表达检测对宫颈病变的诊断具有更强的参考价值。

本研究发现，在不同年龄阶段的宫颈病变患者中，HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测结果与Dominik P［10］等的报道一致。亦有研究提示，高年龄段患者HPV-E6/E7-mRNA 检出率高于低年龄段患者［11］，但本研究发现，≥61 岁年龄组患者HPV-E6/E7-mRNA 检出率仅为78.6%，略低于其他各年龄组，该差异有可能是因为本研究中该组样本量过少（14 例）而导致的统计偏差，有待于后续扩大样本量进一步验证。

在TCT 检测结果为炎症或正常的患者中，本研究显示，HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率（23.6%）显著低于HPV-DNA（41.2%）（P<0.001），其与Baron 等［12］和林晓虹等［13］的报道一致。本现象可能是由于HPV 感染属于非持续性或一过性感染，HPV-E6/E7片段尚未整合至宫颈细胞基因组中，导致其未能有效转录和表达。在TCT 检测结果与既往的研究报道基本一致［14］，提示HPV-E6/E7-mRNA检测较HPV-DNA检测在宫颈病变诊断中具有更高的参考价值。随着宫颈病变病理级别的升级，HPV-E6/E7-mRNA 阳性检出率呈现先升高后降低的趋势，本研究结果与田莉等［15］的报道不相符，分析其原因可能为：一方面可能由于样本量过少（ASC-H 组仅20 例，HSIL 组仅16 例）而导致的统计结果偏差；另一方面可能由于TCT 诊断结果与病理活检结果存在差异。

本研究中HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测的灵敏度、特异度的比较结果与陈丹等［16］的研究报道较一致，提示HPV-E6/E7-mRNA 阳性患者发生宫颈病变的风险较大，而HPV-E6/E7mRNA阴性患者可能为一过性HPV 感染，发生宫颈病变的风险较小。本研究结果亦显示，HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测的阳性预测值、阴性预测值的比较结果与梁海燕等［17］和Yang 等［18］的研究报道一致，提示针对于宫颈疾病的筛查和诊断，HPV-E6/E7-mRNA检测相对于HPV-DNA 具有更高的参考价值。

综上所述，本研究结果提示，HPV-E6/E7-mRNA和HPV-DNA检测在宫颈病变筛查和诊断中均有一定的参考价值，但HPV-E6/E7-mRNA检测较HPV-DNA 具有更高的灵敏度，特异度，阳性预测值和阴性预测值，提示其有望成为宫颈病变诊断和筛查的更有效指标。