METTL3和ALKBH5在甲状腺癌中的表达

谭屾 崔爱民 柏楠 查晔军 卢帅

甲状腺癌（thyroid carcinoma，TC）是女性第六大常见癌症，女性患TC 的几率是男性的三倍，大约2%的病例发生在儿童和青少年［1］。因此，探究TC发病的影响因素有助于TC 的防治。N6-甲基腺苷（N6-methyladenosine，m6A）是哺乳动物mRNA 最为丰富的甲基化修饰形式，m6A 甲基化是一种动态的、可逆的修饰，主要发生在3＇非翻译区和终止密码子6 附近［2］。甲基转移酶样3（methyltransferase like 3，METTL3）、METTL14和成肾细胞瘤1-结合蛋白共同组成m6A 甲基转移酶复合物。METTL3表达受到干扰会导致m6A 总甲基化的改变，这将直接影响mRNA 的稳定性或翻译，导致细胞功能失调［3］。研究发现，METTL3水平在肾癌中升高，可提高肿瘤细胞增殖、转移和侵袭的能力［4］。alkB 同系物5（alkB homolog 5，ALKBH5）是m6A去甲基化酶之一，参与m6A 的修饰过程，其在弥漫性胃腺癌中mRNA 水平明显低于正常胃组织，与胃癌细胞的迁移和侵袭能力呈负相关［5］。目前METTL3和ALKBH5表达在TC 中研究较少。本研究分析二者表达与TC 病情及患者长期生存的关系，期望为TC 的诊断及防治提供参考。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2014年3月至2015年9月于北京积水潭医院住院治疗的116 例TC 患者作为研究对象，获取患者手术时的癌组织标本（TC 组）及癌旁组织标本（距癌组织2 cm 以上，对照组），所有患者均经术后病理诊断确诊为TC［6］，其中男50 例，女66例，年龄（52.96±10.76）岁。纳入标准：①术前未经放化疗等抗肿瘤方式治疗；②患者或家属对本研究内容知情，同意参加本次试验；③临床资料完整。排除标准：①有细胞分子靶向治疗史者；②合并甲状旁腺癌、肺癌等其他癌症者；③患有甲亢、甲减等甲状腺疾病；④患有下丘脑、垂体功能障碍患者。本研究经北京积水潭医院伦理委员会批准。

1.2 研究方法

1.2.1 检测METTL3mRNA、ALKBH5mRNA 表达水平

严格按照RNA 提取试剂盒（货号：YT9197，北京伊塔生物科技有限公司）说明书提取组织总RNA，使用反转录试剂盒（货号：KL266，上海康朗生物科技有限公司）将从组织中提取的总RNA 反转录得cDNA。采用qRT-PCR 仪（型号：7700，美国Applied Biosystems 公司）对METTL3mRNA、ALKBH5mRNA 和内参GAPDH进行扩增，反应条件：95℃预变性5 min；95℃30 s，58℃30 s，72℃30 s，40 个循环。癌及癌旁组织中METTL3mRNA、ALKBH5mRNA 的相对表达量根据公式2-ΔΔCT计算，取3 次的平均值。引物序列由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成。见表1。

表1 引物序列Table 1 Primer sequence

1.2.2 随访

从TC 患者手术后开始随访，手术后前3年每3 个月随访1 次，之后每6 个月随访1 次，主要随访方式为打电话和门诊复查，以患者死亡或随访截至2020年9月作为随访终点。

1.3 统计学分析

使用SPSS 25.0 统计软件进行数据统计分析。计量资料以（）表示（均符合正态分布），行t检验；计数资料以n（%）表示，采用χ2检验；采用Pearson 法进行TC 组织中METTL3mRNA、ALKBH5mRNA 表达相关性分析；以Kaplan-Meier法进行分析METTL3、ALKBH5表达与患者五年内总生存率的关系；以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 两组METTL3 mRNA、ALKBH5 mRNA 水平比较

TC 组METTL3mRNA 水平高于对照组，ALKBH5mRNA 水平低于对照组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表2。

表2 两组METTL3 mRNA、ALKBH5 mRNA 水平比较［n（%）］Table 2 Comparison of METTL3 mRNA and ALKBH5 mRNA levels between the two groups［n（%）］

2.2 TC 组织METTL3 mRNA、ALKBH5 mRNA 表达水平与临床病理特征的关系

不同METTL3、ALKBH5表达患者年龄、性别、肿瘤大小比较，差异无统计学意义（P>0.05）；METTL3高表达组患者TNM Ⅲ期、淋巴结转移比例高于低表达组，ALKBH5低表达组TNM Ⅲ期、淋巴结转移比例高于高表达组，差异均有统计学意义（P＜0.05）。见表3。

表3 TC 组织METTL3 mRNA、ALKBH5 mRNA 表达水平与临床病理特征的关系（±s）Table 3 Relationship between the expression levels of METTL3 mRNA and ALKBH5 mRNA in TC tissues and clinicopathological features（±s）

表3 TC 组织METTL3 mRNA、ALKBH5 mRNA 表达水平与临床病理特征的关系（±s）Table 3 Relationship between the expression levels of METTL3 mRNA and ALKBH5 mRNA in TC tissues and clinicopathological features（±s）

组别对照组TC 组t 值P 值n 116 116 METTL3 mRNA 1.03±0.22 2.62±0.27 24.284 0.000 ALKBH5 mRNA 0.99±0.26 0.48±0.21 16.435 0.000

2.3 TC组织中METTL3 mRNA与ALKBH5 mRNA表达水平的相关性

TC 组织中METTL3mRNA 与ALKBH5mRNA表达水平呈负相关（r=-0.589，P=0.000）。

2.4 TC 患者Kaplan-Meier 生存分析

入组TC 患者5年总生存93 例，死亡23 例。METTL3高表达组五年总生存率为67.80%，低于METTL3低表达组的92.98%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=11.540，P=0.001）；ALKBH5低表达组五年内总生存率为70.00%，低于ALKBH5高表达组的91.07%，差异有统计学意义（Log-rankχ2=8.090，P=0.005）。见图1。

图1 METTL3、ALKBH5 表达与五年内总生存率的关系Figure 1 Relationship between the expression of METTL3 and ALKBH5 and 5-year overall survival rate

2.5 单因素及多因素Cox 回归分析

单因素Cox 分析结果显示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移及METTL3高表达、ALKBH5低表达是影响TC 预后的危险因素（P＜0.05）。多因素Cox 回归分析结果显示，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移及METTL3高表达、ALKBH5低表达是影响TC 预后的独立危险因素（P＜0.05）。见表4。

表4 影响TC 预后的多因素Cox 回归分析Table 4 Multivariate Cox regression analysis of prognostic factors of TC

3 讨论

TC 是最常见的内分泌癌，全世界每年约有55万人患TC，全球女性发病率为10.2/10 万，男性为3.1/10 万［7］。TC 的主要发病类型是甲状腺乳头状癌（papillary thyroid carcinoma，PTC），约占所有病例的85%以上［8］，在某些具有区域性浸润的PTC 患者中，手术效果不理想，术后约有30%的病例呈现持续性症状，也会有相当高的复发率和死亡率［9］。因此，加强对TC 的检测对于防治TC 具有重要意义。

METTL3是一种分子量为70 KDa 的蛋白，其蛋白结构包含对甲基转移酶活性非常重要的两个结构域。研究发现，METTL3可以与METTL14以1∶1 比例结合形成稳定的异质二聚体，起到识别RNA 底物的作用，共同催化m6A 的形成［10］。有研究发现，宫颈癌、乳腺癌中METTL3水平上调，促进肿瘤细胞增殖，与肿瘤的大小、分期、分化、转移及复发呈负相关，可引起肿瘤患者预后不良［11-12］。Wang 等［13］研究报道，TC 进展中METTL3表达水平明显升高，与患者不良预后有关。本研究结果显示，TC 患者癌组织中METTL3mRNA 表达水平明显高于癌旁组织，且METTL3高表达组患者TNMⅢ期、淋巴结转移比例高于低表达组，五年总生存率低于低表达组，与Wang 等［13］研究结果一致，提示METTL3高表达可能与TC 恶性进展密切相关。METTL3表达上调可能通过影响TCF1 等基因上的m6A 甲基化促进TC 进展［13］。

ALKBH5是AlkB 家族成员之一，体内ALKBH5水平异常将影响mRNA 的稳定性并影响相关蛋白的表达，从而造成癌变的风险［14］。在胰腺导管腺癌中，ALKBH5表达水平被下调，预示着胰腺导管腺癌患者临床结局较差［15］，ALKBH5缺失是胰腺癌患者发生和临床病理表现不佳的特征，同时ALKBH5的过度表达则降低了体外肿瘤的增殖、迁移和侵袭活性，抑制了体内肿瘤的生长［16］。本研究结果与陆瑛等［5］研究结果基本相似，提示ALKBH5可能与TC 的发生有关。分析原因，可能由于细胞中ALKBH5水平过低，引起mRNA 修饰及后期的蛋白表达水平异常，导致细胞的癌变，并促进肿瘤细胞的增殖和迁移。本研究结果提示ALKBH5低表达可能与TC 的进展有关。而ALKBH5低表达患者具有更低的五年内总生存率，提示ALKBH5表达可能通过影响TC 细胞的侵袭、迁移能力，从而影响患者生存率低等不良预后发生。本研究中TC 组织中METTL3mRNA 与ALKBH5mRNA 表达水平呈负相关，且Cox 回归分析发现，TNM 分期Ⅲ期、淋巴结转移及METTL3高表达、ALKBH5低表达是影响TC 预后的独立危险因素，进一步表明METTL3高表达、ALKBH5低表达可能存在相互作用，均与TC 患者不良预后发生密切相关。

综上所述，METTL3在TC 组织中高表达、ALKBH5在TC 组织中低表达，二者与患者的TNM分期升高、淋巴结转移及五年内总生存率低等不良预后发生有关，可能可作为治疗TC 的新靶点。