甲状腺乳头状癌细针穿刺吸取细胞学中TROP-2表达及其临床意义

杨路路，田智丹，王 粮，王劲松，赵有财

甲状腺乳头状癌(papillary thyroid carcinoma, PTC)是一种常见的高分化甲状腺癌，占甲状腺癌的80%～90%[1]，其发病率呈逐年上升趋势。目前，超声引导下细针穿刺吸取细胞学检查(fine needle aspiration cytology, FNAC)是术前评估甲状腺结节性质最可靠的诊断手段。PTC的病理诊断主要依靠其组织学及细胞核的特征，如乳头状结构、核沟、核内包涵体及毛玻璃核等，但一些非肿瘤性病变也可出现PTC细胞学改变，导致诊断困难，尤其是在FNAC标本中。近年，免疫组化标志物如Galectin-3、HBME-1、CK19等有助于PTC的诊断[2-4]，但其灵敏度或特异度较差。研究发现TROP-2过表达对手术切除标本PTC的诊断具有较高的敏感性和特异性[5-6]，目前细胞学标本中TROP-2的表达及其临床意义报道较少。本文着重探讨TROP-2在甲状腺良恶性结节中的表达，分析其在细胞学PTC中表达的临床意义及诊断价值，为其治疗提供参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2018年1月1日～2019年8月31日我院行甲状腺结节FNAC标本105例，其中PTC 86例，良性甲状腺结节(benign thyroid nodules, BTN)19例(术后诊断为结节性甲状腺肿、结节性甲状腺肿伴乳头状增生、结节性甲状腺肿伴腺瘤样增生、甲状腺腺瘤、桥本甲状腺炎/慢性淋巴细胞性甲状腺炎等)。PTC组中男性22例，女性64例，年龄22～67岁，平均(41.6±11.6)岁；BTN组中男性7例，女性12例，年龄24～67岁，平均(46.5±13.2)岁。入选标准：(1)所有患者均在超声引导下行甲状腺细针穿刺涂片及制备细胞蜡块；(2)排除肿瘤细胞数较少的标本；(3)均接受相应手术切除+部分患者行区域淋巴结清扫，均经术后病理确诊；(4)术前均无相关内分泌治疗及放、化疗；(5)无其它恶性肿瘤病史；(6)有完整的临床病理资料。

1.2 方法(1)细针穿刺吸取细胞涂片及蜡块制备：取适量细针穿刺吸取的细胞样本，均匀涂抹于载玻片上，经95%乙醇固定，15 min后行HE染色。将细针穿刺细胞涂片后的剩余标本注入细胞保存液中，静置后离心，在沉淀物中加入10%中性福尔马林固定，再次离心后吸取上清液，加入95%乙醇静置1～2 h，待细胞样本凝集成块后，将其收集于滤纸中，常规固定、脱水、石蜡包埋。(2)免疫组化：采用EnVision法染色，一抗TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19，均购自北京中杉金桥公司，具体操作步骤严格按试剂盒说明书进行。同时设阳性和阴性对照：以试剂盒中提供的强阳性切片作为阳性对照，用PBS代替一抗作为阴性对照。

1.3 结果判定TROP-2阳性定位于细胞膜，阳性判读以阳性肿瘤细胞占总肿瘤细胞数的百分比，将>5%肿瘤细胞完整膜表达作为TROP-2阳性的最佳阈值[7]。Galectin-3定位于细胞膜，部分细胞核亦着色。HBME-1与CK19阳性均定位于细胞质、细胞膜，其阳性阈值参照TROP-2。切片均由两名资深病理医师采用双盲法阅片，当判读结果不一致时，在多头显微镜下同时观察分析，并达到意见统一。

1.4 统计学分析应用SPSS 23.0软件进行统计学分析，采用χ2检验对PTC组和BTN组中TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表达进行比较；计算TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值及准确度，并进行ROC曲线绘制，比较ROC曲线下面积(area under curve, AUC)以评价各指标的诊断效能。TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19与淋巴结转移之间关系采用χ2检验或Fisher精确概率法，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 病理特点PTC细胞学主要表现为细胞排列拥挤，细胞核增大，核似毛玻璃样，可见核沟、核内包涵体，具有纤维血管轴心的乳头状结构(图1、2)。BTN主要呈滤泡上皮细胞均匀分布，细胞形态温和，核小而圆，其中2例见乳头状结构(图3)。

2.2 PTC和BTN中TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的表达TROP-2在PTC组中阳性率为95.3%(82/86)(图4)，在BTN组中阳性率为5.3%(1/19)；PTC中TROP-2的阳性率明显高于BTN(P<0.05)，而在BTN组中仅1例桥本甲状腺炎TROP-2阳性。Galectin-3、HBME-1、CK19在PTC中的阳性率分别为82.6%(71/86)、81.4%(70/86)、90.7%(78/86)，在BTN组中的阳性率分别为5.3%(1/19)、15.8%(3/19)、21.1%(4/19)，差异有统计学意义(P<0.05，表1)。本组1例细胞学检查见乳头状结构，术后证实为结节性甲状腺肿伴乳头状增生的病例，CK19呈阳性(图5)，但TROP-2阴性(图6)。

①②③④⑤⑥

表1 甲状腺乳头状癌、良性甲状腺结节中TROP-2、Galectin-3、HBME-1及CK19的表达[n(%)]

2.3 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19的诊断效能比较本实验结果显示：TROP-2对于诊断PTC的灵敏度(95.3%)、特异度(94.7%)、阳性预测值(98.8%)、阴性预测值(81.8%)及准确度(95.2%)均为最高。灵敏度：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1；特异度：TROP-2=Galectin-3>HBME-1>CK19；阳性预测值：TROP-2>Galectin-3>HBME-1>CK19；阴性预测值：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1；准确度：TROP-2>CK19>Galectin-3>HBME-1。四项指标诊断PTC的AUC分别为0.950、0.886、0.828、0.848，以TROP-2诊断效能最高(表2，图7)。

表2 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19在甲状腺乳头状癌中的诊断效能比较

图7 TROP-2、Galectin-3、HBME-1及CK19诊断PTC、BTN的ROC曲线图

2.4 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表达与PTC淋巴结转移的关系本组中PTC颈部淋巴结转移率为51.2%(44/86)，结果显示TROP-2及CK19表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)；而Galectin-3、HBME-1与淋巴结转移之间无相关性(P>0.05，表3)。

3 讨论

甲状腺结节临床相对常见，多数为良性病变，其恶性结节中最常见的是PTC。随着FNAC的应用，PTC的检出率明显提高[8-9]。PTC具有相对惰性生物学行为，预后较好，但易发生早期颈部淋巴结转移，增加患者局部复发和远处转移的风险[10-12]。因此，术前对甲状腺结节的准确评估及淋巴结转移风险的预判，对于确定手术方式以及是否行预防性颈部淋巴结清扫具有重要意义。

Galectin-3、HBME-1和CK19在PTC中具有较强的表达，对于鉴别PTC和BTN有辅助作用，但灵敏度或特异度有局限性。TROP-2是一种由TACSTD2基因编码表达的细胞跨膜蛋白，最初在人类滋养层细胞和绒毛膜癌细胞系中发现。研究表明TROP-2在正常组织中低表达或失表达，其发挥抑癌基因作用，而在多种恶性肿瘤组织中TROP-2呈过表达，如结直肠癌、胃癌、胰腺癌、非小细胞肺癌、子宫内膜样癌和卵巢癌等[13]。Finley等[14]采用类聚分析和寡核苷酸阵列法分析14例PTC和21例良性甲状腺肿瘤的基因表达模式，发现PTC与良性肿瘤组间存在明显的基因表达差异，TROP-2在PTC中过表达。本组前期发现PTC中表达TROP-2，而在其它甲状腺恶性肿瘤和良性病变中均不表达，TROP-2对于PTC诊断具有较高的敏感性和特异性[6]。TROP-2与Galectin-3、HBME-1及CK19在诊断PTC的灵敏度和特异度报道不一。Simms等[7]分析331例甲状腺癌和BTN中TROP-2的表达，结果显示TROP-2诊断经典型PTC的灵敏度和特异度分别为90%和95.2%，与以往研究相比，TROP-2的灵敏度和特异度均高于Galectin-3、HBME-1和CK19。然而，Murtezaoglu等[15]报道TROP-2在PTC中的表达高于良性甲状腺病变，但其准确度低于HBME-1和Galectin-3，灵敏度低于CK19、HBME-1和Galectin-3。这可能与研究者采用的抗体克隆号不同、阳性阈值不同等因素有关。

本实验采用文献推荐的5%阳性肿瘤细胞数作为细胞学标本中TROP-2阳性阈值，结果显示TROP-2在PTC中阳性率达95.3%，与文献报道一致[7,16]。TROP-2对于鉴别PTC与BTN的灵敏度为95.3%、特异度为94.7%、阳性预测值为98.8%、阴性预测值为81.8%，准确度为95.2%，均高于Galectin-3、HBME-1和CK19。Abdou等[17]报道TROP-2在甲状腺细胞学标本中诊断PTC的灵敏度及特异度达均为100%，其在细胞学标本中的诊断效能优于手术切除标本，但该研究中细胞学标本的病例较少。本组也发现TROP-2在细胞学标本中诊断PTC的灵敏度，高于前期研究中其在手术标本中的灵敏度[6]，进一步证实TROP-2在甲状腺细胞学标本中具有较高的辅助诊断价值。本组进一步分析TROP-2、Galectin-3、HBME-1和CK19对于诊断PTC的效能，TROP-2的AUC为0.950，高于Galectin-3、HBME-1及CK19；TROP-2对于细胞学鉴别PTC与BTN具有较高的诊断效能。

表3 TROP-2、Galectin-3、HBME-1、CK19表达与甲状腺乳头状癌淋巴结转移的关系

本组中除1例桥本甲状腺炎，其余BTN TROP-2均不表达。桥本甲状腺炎中嗜酸性变的滤泡上皮具有PTC样核改变，可能携带与经典PTC相同的基因突变(RET/PTC重排)，该突变激活MAPK通路，直接或间接促进TROP-2表达[18]，也可能与这些细胞具有较高的内源性生物素活性，显示抗体的异常阳性染色模式；提示桥本甲状腺炎的嗜酸性变滤泡上皮可能存在TROP-2表达，给鉴别诊断带来困难，需结合其它细胞病理学特征进行鉴别。桥本甲状腺炎通常伴较多的淋巴细胞，嗜酸性变滤泡上皮的胞质丰富嗜酸，核仁明显，虽然也可偶见核沟，但这些非典型细胞的核质比较低，而PTC肿瘤细胞核质比高，异型性明显，可与桥本甲状腺炎进行鉴别。本组前期发现PTC中TROP-2表达与BRAF V600E基因突变呈正相关[6]，对于鉴别诊断困难的病例可以结合BRAF V600E基因突变状况进行诊断。本实验尚存在局限与不足，纳入的良性细胞学病例数较少，需积累病例进一步分析。

Guan等[19]研究显示TROP-2表达与淋巴结转移和侵袭性行为密切相关。本组前期研究也显示TROP-2在PTC手术标本中表达与淋巴结转移呈正相关[6]。本实验结果发现在FNAC标本中TROP-2过表达与淋巴结转移呈正相关(P<0.05)，44例淋巴结转移的PTC均表达TROP-2，而TROP-2不表达的4例PTC均未发现淋巴结转移。有研究认为TROP-2通过AP-1增强甲状腺癌细胞的侵袭和转移能力，导致MMP-2上调，引起Ⅵ型胶原蛋白的降解，从而协助肿瘤组织向细胞外基质扩散，促进肿瘤的增殖与转移[20]。

总之，TROP-2是诊断PTC的一种高度敏感性和特异性的免疫组化标志物，可进一步提高甲状腺FNAC诊断的准确性；且TROP-2表达与PTC颈部淋巴结转移呈正相关。根据TROP-2的表达、BRAF V600E基因突变状况及影像学检查，可为临床是否行预防性颈部淋巴结清扫提供参考。