弥漫大B细胞淋巴瘤中p-STAT3的表达与临床预后及肿瘤相关巨噬细胞的关系

闻照凤，黄绮堂，胡泉泉，李 雨，朱 俊，王 弦,3，李延莉,4

弥漫大B细胞淋巴瘤(diffuse large B cell lymphoma, DLBCL)是最常见的成人非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma, NHL)，占NHL的30%～40%，临床表现为高度侵袭性，在分子生物学、临床特征及预后等方面存在高度异质性，虽然其标准治疗方案R-CHOP的应用大幅度提高患者的存活率，但仍有近1/3的患者发生耐药或复发导致死亡[1]。因此，寻找新的指标预测患者预后及评估治疗反应是亟待解决的问题。信号转导及转录活化因子(signal transducer and activator of transcription, STAT)家族是一类具有细胞信号转导及转录双重功能的因子，参与调控正常细胞的多种活动，如细胞分化、增殖、血管生成等[2]。STAT3是STAT家族重要的一员，可被多种因素激活成为磷酸化STAT3(p-STAT3)，进而参与各种正常或异常细胞活动。近年，越来越多的研究发现STAT3和p-STAT3在多种肿瘤中过表达且与临床预后密切相关[3-6]。肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的主要组成成分之一，参与多种肿瘤的增殖、侵袭、血管生成和转移等过程[7]。Li等[8]证实肿瘤相关巨噬细胞与DLBCL预后相关，肿瘤相关巨噬细胞标志物CD68和CD163表达越高，患者总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression-free survival, PFS)越低。目前，用p-STAT3预测DLBCL患者预后及p-STAT3与肿瘤相关巨噬细胞相关性的报道较少。本文采用免疫组化法检测228例DLBCL中p-STAT3的表达，分析其与预后、肿瘤相关巨噬细胞的关系，以期为DLBCL患者的治疗提供新参考。

1 材料与方法

1.1 临床资料收集2004～2015年安徽医科大学第一、二附属医院确诊的228例DLBCL，其中女性107例，男性121例；<60岁者134例，≥60岁者94例；ECOG-PS评分≤1分者140例，>1分者88例；淋巴结外累积部位≤1处者181例，>1处者47例；Ann Arbor分期：Ⅰ+Ⅱ期者129例，Ⅲ+Ⅳ期者99例；LDH正常165例，升高63例；IPI评分≤2分者159例，≥3分者69例。

1.2 免疫组化采用免疫组化EnVision法检测DLBCL组织中p-STAT3的表达。组织标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋，切片厚4 μm。一抗为兔抗人p-STAT3单克隆抗体(Tyr705)(稀释比1 ∶200)，购自DAKO公司。石蜡切片常规脱蜡至水，用pH 6.0的柠檬酸盐溶液高压修复抗原，室温冷却后PBS冲洗，滴加3%H2O2阻断内源性过氧化物酶，加一抗4 ℃过夜，恢复至室温滴加二抗，37 ℃孵育10 min，DAB显色，经苏木精染色，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封固。阴性对照切片的一抗使用PBS替代。

1.3 结果判断p-STAT3染色定位于肿瘤细胞胞质和胞核，主要表达于细胞核。根据阳性细胞数和着色强度进行评分：(1)按阳性细胞百分比进行评分：阳性细胞数<10%为0分，10%～30%为1分，31%～80%为2分，>80%为3分[9]；(2)按细胞着色程度进行评分：无着色为0分，淡黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分。将两项得分相乘：≤2分为低表达，≥3分为高表达[10]。CD68主要表达于巨噬细胞胞质，CD163表达主要定位于巨噬细胞胞膜。首先在低倍(100倍)镜下初步观察整张切片，再随机选择5个代表性的高倍视野(400倍)，计数CD68和CD163阳性细胞数。所有切片计数在1个月后重复，取2次计数的平均值作为该样本表达的最终结果。以ROC曲线分析确定最佳截断值分为CD68、CD163强阳性组和弱阳性组[8]。

1.4 统计学分析应用SPSS 20.0软件进行统计学分析；采用χ2分析p-STAT3表达与临床病理特征的关系；Spearman分析两指标间的相关性；Kaplan-Meier绘制患者生存曲线；Cox风险比例回归模型进行预后的单因素和多因素分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 DLBCL中p-STAT3的表达p-STAT3表达主要定位于DLBCL胞质和胞核，呈棕褐色(图1)。在228例DLBCL患者中，p-STAT3阴性136例(59.6%)、阳性92例(40.4%)。

2.2 DLBCL中p-STAT3表达与临床特病理征、肿瘤相关巨噬细胞的关系本组CD68弱阳性143例，强阳性85例；CD163弱阳性126例，强阳性102例。免疫分型：GCB型65例，non-GCB型61例；BCL-2阳性33例，阴性15例；BCL-6阳性25例，阴性23例。结果显示：p-STAT3的表达在ECOG-PS评分、结外累积部位、Ann Arbor分期、LDH水平、IPI评分、治疗反应、CD68、CD163、BCL-2表达和免疫分型方面差异有显著性(P<0.05，表1)。

表1 弥漫大B细胞淋巴瘤中p-STAT3表达与临床病理特征及肿瘤相关巨噬细胞的关系

AB

2.3 DLBCL中p-STAT3表达与预后的关系Kaplan-Meier生存曲线分析：IPI评分0～3分的低风险和中风险DLBCL患者中，p-STAT3阳性患者的OS和PFS与阴性患者相比显著降低，而在IPI评分4～5分的高风险患者中p-STAT3阳性患者的OS显著降低，PFS未出现显著差异(图2)。本组采用标准化疗方案(CHOP或R-CHOP)治疗后，疾病进展71例，缓解157例。Cox单因素分析显示：患者年龄、ECOG-PS评分、结外累积部位、Ann Arbor分期、LDH水平、IPI评分、治疗反应、CD68、CD163和p-STAT3均是DLBCL预后的影响因素。Cox多因素回归分析显示：LDH水平、治疗反应、CD163表达和p-STAT3表达是DLBCL预后的独立影响因素(表2、3)。

图2 IPI不同评分中p-STAT3表达与OS、PFS的关系：IPI评分0～1分中p-STAT3阳性组与阴性组的OS(A)和PFS(B)；IPI评分2～3分中p-STAT3阳性组与阴性组的OS(C)和PFS(D)；IPI评分4～5分中p-STAT3阳性组与阴性组的OS(E)和PFS(F)

表2 弥漫大B细胞淋巴瘤患者总生存期的Cox单因素和多因素分析

表3 弥漫大B细胞淋巴瘤患者无进展生存期的Cox单因素和多因素分析

2.4 DLBCL中肿瘤相关巨噬细胞标志物CD68与CD163表达的相关性在DLBCL中，CD68、CD163共同强阳性率为53.7%(121/228)，共同弱阳性率为35.1%(80/228)。Spearman相关分析结果显示：DLBCL中CD68与CD163表达呈正相关(r=0.766，P<0.001，表4)。

表4 弥漫大B细胞淋巴瘤中CD68和CD163表达的相关性分析

2.5 DLBCL中p-STAT3表达与CD68/CD163表达的相关性Spearman相关分析结果显示，DLBCL中p-STAT3表达与CD68呈正相关(r=0.660,P<0.001)；与CD163呈正相关(r=0.590，P<0.001，表5)。

表5 弥漫大B细胞淋巴瘤中p-STAT3与CD68/CD163表达的相关性分析

3 讨论

STAT3包含STAT3ɑ、STAT3β、STAT3γ、STAT3δ四种亚基[11]，是信号转导与转录活化因子STAT家族中的重要一员，具有信号转导及转录双重功能，可被多种细胞因子、生长因子和基因激活，参与各种生理及病理过程。近年，越来越多的研究证明STAT3和p-STAT3在多种肿瘤中过表达且对预后起一定预测作用。Zhao等[12]通过分析202例食管鳞状细胞癌组织中STAT3表达发现，STAT3是食管鳞状细胞癌患者的独立预后因素，阳性患者的OS和PFS明显降低。Tang等[13]发现肝癌组织中STAT3阳性与肝癌患者的复发及预后密切相关；王凡夫等[14]也发现与癌旁肝组织和肝硬化组织相比，原发性肝癌组织中STAT3高表达，且与原发性肝癌的发生、发展密切相关。此外，有研究发现STAT3在胃癌中高表达，并且是胃癌患者的独立不良预后因素[15]；p-STAT3也被证实是雌激素受体阴性乳腺癌患者的独立不良预后因素[16]。

肿瘤相关巨噬细胞是肿瘤微环境的主要组成成分，分为抑制肿瘤进展的M1型和促进肿瘤进展的M2型[17]。近年，多个研究发现在不同的肿瘤中STAT3表达与肿瘤相关巨噬细胞之间存在相互联系。如乳腺癌肿瘤微环境中的肿瘤细胞通过p38-MAPK通路诱导肿瘤相关巨噬细胞分泌IL-6，进而激活肿瘤细胞的STAT3通路促进肿瘤干细胞增殖及肿瘤进展[18]。用肿瘤相关巨噬细胞的培养上清作用非小细胞肺癌细胞后，肿瘤细胞的STAT3被激活，诱导肿瘤细胞增殖、发生免疫逃逸和耐药，而IL-6受体拮抗剂则抑制肿瘤相关巨噬细胞上清对肿瘤细胞产生影响[19]；Zhang等[20]证实肺癌微环境中肿瘤相关巨噬细胞分泌的IFNγ可激活肺癌细胞的JAK/STAT3信号通路，使肿瘤细胞表达PD-L1，进而促进肺癌进展。

本组228例DLBCL患者中p-STAT3阳性92例(40.4%)，p-STAT3阴性136例(59.6%)。p-STAT3阳性与ECOG-PS评分、结外累积部位、Ann Arbor分期、LDH、IPI评分、治疗反应、CD68和CD163和BCL2表达均有关。在不同IPI评分的患者中，STAT3阳性患者的OS明显降低，而在IPI评分4～5分患者中STAT3是否表达与PFS无显著差异。Cox单因素和多因素分析发现，p-STAT3是DLBCL患者不良预后的独立影响因素；Spearman相关分析发现，p-STAT3的表达与肿瘤相关巨噬细胞呈正相关，以上结果均表明p-STAT3在肿瘤微环境中起重要作用。Tamma等[21]发现DLBCL组织中p-STAT3高表达且与CD163/CD4表达呈正相关。Ling等[22]发现DLBCL细胞分泌的外泌体促进肿瘤相关巨噬细胞的STAT3活化，并激活下游通路促进肿瘤相关巨噬细胞向M2型极化，最终促使肿瘤进展。Hashwah等[23]发现DLBCL细胞表达IL-6受体，被肿瘤微环境中的IL-6激活IL-6R/gp130/p-STAT3通路，进而促进DLBCL的进展。Stirm等[24]证实一种DLBCL细胞亚群分泌IL-10作用于自身表达的IL-10受体，进而激活肿瘤细胞自身STAT3促进肿瘤增殖。

综上所述，p-STAT3阳性是DLBCL患者的独立预后不良因素，与肿瘤微环境中的肿瘤相关巨噬细胞呈正相关，可以有效预测患者预后，其在肿瘤微环境中的作用则需要深入分析。