结直肠癌中Keap1、Nrf2、Gpx4表达与铁死亡的相关性分析及临床意义

路丽祯，何 双，温菲菲，崔忠泽，武 寒，徐 磊，吴淑华

结直肠癌是最常见的恶性肿瘤，其发病率逐年上升且呈年轻化趋势[1]。结直肠癌的发生、发展是一个长期、多阶段、多基因改变的过程，具有基因控制和多因素调节的复杂性[2]。新近研究发现铁死亡(ferroptosis)参与多种肿瘤的发生、发展。铁死亡是一种铁依赖性、以细胞内脂质活性氧积累为特征的非凋亡性调节性细胞死亡形式，与多种肿瘤的发生和治疗反应有关[3-4]。研究显示，在铁死亡发生过程中核转录因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2, Nrf2)、Kelch样ECH相关蛋白1(Kelchike Ech-associated protein 1, Keap1)、谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, Gpx4)等均发挥重要作用[5]。本文检测结直肠癌中Keap1、Nrf2、Gpx4以及铁死亡相关标志因子GSH、MDA、PLOOH和组织铁的表达，探讨其与临床病理特征的相关性及其临床意义，为寻找新的肿瘤治疗靶点及缓解耐药提供思路。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1临床资料 收集2016～2017年滨州医学院附属医院病理科存档的具有完整随访资料的T2高危及T3期结直肠癌患者106例，术后均采用FOLFOX化疗方案。根据WHO(2019)消化系统肿瘤分类标准，由两位资深病理专家采用双盲法阅片重新诊断。其中，男性56例，女性50例；年龄47～75岁，中位年龄65岁；肿瘤最大径≥5 cm者44例，<5 cm者62例；组织学类型：管状腺癌86例，黏液腺癌20例；分化程度：高分化13例，中分化82例，低分化11例；浸润深度：侵犯肌层34例，侵及或浸透外膜者72例；有淋巴结转移者20例，无淋巴结转移者86例。所选病例均为首次发现，术前均未行任何放、化疗。同时，选取距病变边缘>5 cm的正常结直肠黏膜组织作为对照。随访截至2021年12月或患者死亡，失访者不予入组。

1.1.2试剂 鼠抗人Keap1(ab119403)、兔抗人Nrf2(ab62352)抗体均购自Abcam公司，兔抗人Gpx4(DF6701)抗体购自Affinity公司，羊抗兔/鼠二抗(ab5878)购自福州迈新公司，免疫组化试剂盒购自北京中杉金桥公司。Western blot实验试剂及MDA、GSH检测试剂盒购自上海碧云天公司，组织铁检测试剂购自Solarbio公司，PLOOH检测试剂盒购自Cayman公司，qRT-PCR实验试剂盒购自Takara公司，特异性引物序列由Takara公司合成。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋。免疫组化采用EnVision法染色，3 μm厚连续切片，脱蜡至水，高压热修复抗原。3%H2O2去除内源性过氧化物酶，加入一抗Keap1(1 ∶100)、Nrf2(1 ∶100)、Gpx4(1 ∶100)于4 ℃过夜，二抗37 ℃孵育30 min，DAB显色，苏木精复染，脱水透明，中性树胶封固。用PBS代替一抗做阴性对照。

1.2.2Western blot法 将新鲜结直肠癌标本采用液氮冷冻，冰上充分研磨新鲜组织后经RIPA裂解，离心后取上清液，使用BCA蛋白定量试剂盒检测蛋白浓度定量，样品煮沸变性后上样、电泳。TBST洗涤15 min×3次，5%的脱脂牛奶室温摇床封闭2 h；加入一抗Keap1(1 ∶1 000)、Nrf2(1 ∶1 000)、Gpx4(1 ∶1 000)于4 ℃孵育过夜；TBST洗涤15 min×3次；二抗室温孵育2 h；TBST洗涤15 min×3次，ECL曝光，用Quantity One软件分析目的蛋白和β-actin的吸光度值，以目的蛋白与β-actin吸光度值的比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.2.3qRT-PCR法 按照Trizol试剂盒说明书提取组织RNA并检测其浓度，在37 ℃ 15 min、85 ℃ 5 s条件下将RNA逆转录成cDNA。PCR反应采用SYBR Green相对定量PCR法，按试剂盒说明书配置25 μL体系反应液，在CFX96T RT-PCR Detection System C1 000上进行扩增(表1)。反应条件：95 ℃ 30 s、GOTO 95 ℃ 5s、60 ℃ 30 s，合计40个循环。采用2-ΔΔCt法计算相对表达量，实验重复3次，结果取其平均值。

表1 qRT-PCR引物序列

1.2.4PLOOH、组织铁、MDA及GSH水平检测 应用组织铁含量检测试剂盒检测结直肠癌组织及正常肠黏膜组织中铁离子的浓度，脂质氧化检测试剂盒检测MDA的浓度，GSH试剂盒测量GSH水平，脂质氢过氧化物试剂盒检测PLOOH的浓度。计算平均光密度值，将数值大于平均值者判为阳性，低于或等于平均值者判为阴性。

1.3 判读标准Keap1、Nrf2主要表达于细胞核或胞质，Gpx4主要表达于胞膜或胞质，在低倍镜下观察10个独立视野，选取5个阳性细胞数最多的视野，采用Image Pro 6.0软件进行半定量分析，检测视野内阳性细胞的积分光密度值，取其平均值。将数值大于平均值者判为阳性，低于或等于平均值者判为阴性。

1.4 统计学分析采用SPSS 26.0软件进行统计学分析。运用Graph pad 8.0及Image J进行图像和数据处理，组间比较采用配对t检验，计数资料采用χ2检验及矫正χ2检验；相关性采用Spearman相关分析及线性回归分析，生存分析采用Kaplan-Meier法，并以Log-rank法检验；采用Cox比例风险回归模型进行多因素生存分析。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 不同肠组织中Keap1、Nrf2及Gpx4的表达106例结直肠癌中Keap1、Nrf2和Gpx4的阳性率分别为60.5%(64/106)、35.8%(38/106)、39.6%(41/106)，其平均光密度值分别为134.87±21.65、114.73±16.22、119.61±15.77，蛋白表达量均高于正常肠黏膜组织，差异有显著性(P<0.05，图1)。

ABCDEF

选取30例结直肠癌及相对应的正常肠黏膜组织检测Keap1、Nrf2及Gpx4蛋白和mRNA表达。Western blot显示结直肠癌组织中Keap1、Nrf2及Gpx4的平均灰度值分别为289 667±4 252、562 761±29 819、1 426 764±68 772，其蛋白相对表达量分别为0.78±0.14、0.70±0.13、0.63±0.10，均高于正常肠黏膜组织，差异有显著性(P<0.05，图2A、B)。qRT-PCR检测结直肠癌组织中Keap1、Nrf2及Gpx4 mRNA的相对表达量，分别为0.80±0.018、0.68±0.019、0.52±0.016，均高于正常肠黏膜组织，差异有统计学意义(P<0.05，图2C)。

图2 Western blot、qRT-PCR检测Keap1、Nrf2及Gpx4在正常肠黏膜及结直肠癌组织中的表达：A.电泳图；B.直方图；C.Keap1、Nrf2、Gpx4 mRNA水平；N.正常肠黏膜组织；T.结直肠癌组织；**P<0.01，***P<0.000 5；****P<0.000 1

2.2 结直肠癌中Keap1与Nrf2、Gpx4表达的相关性分析应用Image J进行图像处理，根据结直肠癌组织中Keap1、Nrf2、Gpx4表达的灰度值，采用线性回归的对数趋势线分析各因子表达间的相关性。本组结果显示：结直肠癌组织中Keap1与Nrf2的表达呈负相关(R2=0.188 1)，Nrf2与Gpx4的表达呈正相关(R2=0.252 7)，差异均有统计学意义(P<0.05，图3)。

图3 线性回归的对数趋势线分析结直肠癌组织中Keap1、Nrf2、Gpx4表达的相关性：A.结直肠癌组织中Nrf2与Keap1表达的关系；B.结直肠癌组织中Gpx4与Nrf2表达的关系

2.3 结直肠癌中组织铁、PLOOH、GSH和MDA的表达结直肠癌中组织铁及PLOOH、GSH、MDA含量的平均光密度值均高于正常肠黏膜，差异有统计学意义(P<0.05，表2)。线性回归的对数趋势线分析表明：结直肠癌组织中PLOOH与组织铁、MDA的表达呈正相关，而与GSH的表达呈负相关(P<0.05，图4)。经与平均光密度值比较判定，PLOOH、组织铁、GSH、MDA在结直肠癌中的阳性率分别为59.4%(63/106)、58.5%(62/106)、37.7%(40/106)、61.3%(65/106)。

表2 结直肠癌和正常肠黏膜中组织铁、GSH、MDA的平均光密度值

图4 线性回归的对数趋势线分析结直肠癌组织中PLOOH与组织铁、MDA、GSH含量的相关性：A.PLOOH与组织铁表达的关系；B.PLOOH与MDA表达的关系；C.PLOOH与GSH表达的关系

2.4 结直肠癌中Keap1、Nrf2、Gpx4表达与铁死亡的相关性分析PLOOH阳性组中Keap1表达高于阴性组，而Nrf2、Gpx4表达则低于阴性组，差异均具有统计学意义。Spearman相关分析显示，PLOOH与Keap1表达呈正相关(r=0.273)，而与Gpx4、Nrf2表达呈负相关(r=-0.304，r=-0.330)，差异均有统计学意义(P<0.05，表3)。

表3 结直肠癌中PLOOH与Keap1、Nrf2、Gpx4表达的相关性

2.5 生存分析本组106例结直肠癌患者中位生存时间为61个月，平均5年生存率为63.2%。Kaplan-Meier分析显示：Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH、浸润深度及淋巴结转移与患者的预后密切相关(P<0.05，图5)。Cox回归模型分析显示：Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH、浸润深度及淋巴结转移是结直肠癌的独立危险因素(P<0.05，表4)。

表4 Cox多因素分析结直肠癌患者预后因素

图5 结直肠癌患者的预后分析：A.Keap1表达与患者生存期的关系；B.Nrf2表达与患者生存期的关系；C.Gpx4表达与患者生存期的关系；D.PLOOH表达与患者生存期的关系；E.浸润深度与患者生存期的关系；F.淋巴结转移与患者生存期的关系

3 讨论

铁死亡是一种不同于细胞坏死、凋亡、自噬等其他形式的新型细胞程序性死亡方式。大量证据表明，铁死亡与多种疾病有关，且多种实体肿瘤中均有铁死亡激活现象[6]。随着人们对铁死亡认识的不断加深，铁死亡在肿瘤发生、发展过程中的促进和抑制肿瘤的双重作用越来越引起人们的关注[7]。有研究发现，胰腺导管腺癌细胞发生铁死亡后可刺激肿瘤生长[8-9]；Li等[10]研究发现，激活铁死亡可以逆转非小细胞肺癌对顺铂的耐药性。由此可见，铁死亡在不同的肿瘤中发挥作用不同，深入研究铁死亡与肿瘤的关系具有重要临床意义。

铁死亡发生的机制复杂，主要通过两条途径启动：内在途径是通过阻断细胞内抗氧化酶的激活而启动；外在途径则通过抑制细胞膜转运蛋白或通过激活多种铁转运蛋白来启动[7]。Gpx4和铁死亡抑制蛋白1(FSP1)则构成了细胞内两个主要的铁死亡防御系统[11]，其中最为经典的是Gpx4介导的抑制铁死亡途径。Gpx4是唯一的用于脂质过氧化物还原的抗氧化酶，其以还原性GSH作为电子供体，可以直接将PLOOH还原为羟基磷脂，使其失去过氧化物的活性，从而抑制铁死亡[12-13]。由于Gpx4在细胞中充当铁死亡的中枢抑制因子[14]，因而其与肿瘤铁死亡的关系受到广泛关注。Lu等[15]研究发现，应用KLF2抑制Gpx4的表达激活铁死亡，抑制肾透明细胞癌细胞迁移和侵袭。Song等[16]通过抑制Gpx4激活铁死亡增强三阴型乳腺癌细胞对化疗药物的敏感性。在结直肠癌中同样存在铁死亡现象，Shen等[17]通过树脂蟾蜍素导致Gpx4失活触发铁死亡，从而抑制结直肠癌细胞的生长。目前，结直肠癌中Gpx4与PLOOH的相关性及其调控尚不清楚。本实验结果显示：尽管在结直肠癌中Gpx4的表达普遍高于正常肠黏膜组织，但其表达却不尽相同，并且与PLOOH的表达量及患者预后呈负相关；提示结直肠癌中Gpx4抑制铁死亡可能与中和PLOOH有关，而高表达的Gpx4可通过抑制铁死亡影响患者预后。因此，通过降低Gpx4的表达、激发肿瘤细胞铁死亡，有可能成为抑制肿瘤、改善患者预后的新策略。结直肠癌中关于干预调控Gpx4的相关研究较少，寻找调控Gpx4的小分子结合位点，通过影响铁死亡进而抑制肿瘤，对于提高结直肠癌的疗效具有重要价值。

转录因子Nrf2是一种帽领(CNC)碱性区亮氨酸拉链(bZIP)转录因子，负责通过激活解毒酶和抗氧化蛋白的基因，促进抗氧化蛋白表达来保护细胞免受氧化损伤，是细胞脂质过氧化的负性调节因子[18]。已有研究表明，Nrf2是启动Gpx4转录的关键因子[19]。Nrf2的活性与Keap1密切相关[20]。Keap1是BTB Kelch蛋白家族的成员，富含624个氨基酸和半胱氨酸，监测各种应激刺激[21]。生理情况下，Nrf2锚定于细胞质中与Keap1结合，Keap1介导Nrf2泛素化降解，使其在细胞内的含量处于较低水平，其转录活性受抑[22]。Keap1与Nrf2结合不稳定，当受氧化应激刺激时，Nrf2被释放随之活化、入核，执行转录功能[23]。Zhao等[24]研究发现，抑制Keap1可增加Nrf2的表达，进而激活GSH转移酶等调节脂质代谢相关蛋白，缓解肝脏脂质沉积。目前，结直肠癌中有关Keap1、Nrf2与Gpx4关系的研究鲜见报道。本实验结果显示，Keap1与Nrf2、Gpx4的表达呈负相关，而与PLOOH呈正相关；提示结直肠癌中铁死亡与Keap1与Nrf2对Gpx4的调控有关。由此我们推测，结直肠癌中存在Keap1/Nrf2-Gpx4-铁死亡途径，在影响铁死亡的过程中发挥重要作用。干预Keap1/Nrf2-Gpx4通路有可能成为促进铁死亡，进而抑制肿瘤进展的重要途经。

铁死亡是由脂质过氧化作用引起的，其最终产物PLOOH是铁死亡的执行者[25]，当PLOOH过度积累时发生铁死亡，其被认为是铁死亡的标志物。近年研究发现，结直肠癌中存在铁死亡现象[26]，但其在结直肠癌发展中的作用以及与铁死亡关键分子变化规律的关系鲜见报道。本实验结果显示：结直肠癌组织中PLOOH、组织铁、GSH及MDA的含量普遍高于正常肠黏膜组织，其中有59.4%的结直肠癌中PLOOH显著高于平均值，同时伴铁死亡相关因子的改变；提示部分结直肠癌中存在铁死亡激活现象。我们推测肿瘤细胞处于高度活跃的增殖和代谢状态，高铁代谢及活跃的氧化应激状态在一定程度上维持了肿瘤旺盛的代谢需求。同时，为避免过多的过氧化物和铁积累而触发铁死亡，肿瘤通过内在的保护机制抑制铁死亡，使肿瘤细胞免受损伤。因此，明确铁死亡的调控机制，对于利用铁死亡抑制肿瘤，进而寻找肿瘤治疗的新途径具有重要意义。本实验结果显示，不仅Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH与铁死亡及患者的预后密切相关，而且是影响结直肠癌患者预后的独立危险因素，结直肠癌的良好预后与高水平的铁死亡有关。由于本组病例术后均接受化疗，进一步提示其良好预后也可能与铁死亡提高了化疗敏感性有关。

综上所述，Keap1、Nrf2、Gpx4、PLOOH以及铁死亡相关因子在结直肠癌中呈不同程度的表达，由于其表达水平不同，患者的预后也不相同。抑制Keap1/Nrf2-Gpx4通路，进而激活铁死亡可能成为结直肠癌治疗的新途径。本实验仅对结直肠癌组织中Keap1、Nrf2、Gpx4表达和铁死亡的相关性及其临床意义进行初步探讨，还需积累更多病例进一步分析，并同时深入开展分子机制研究，为利用铁死亡抑制肿瘤发展、改善结直肠癌患者预后提供新思路。