运输密度对团头鲂肌肉特性的影响

彭 玲，尤 娟，汪 兰，廖 涛，熊善柏，尹 涛

(1.华中农业大学食品科学技术学院，国家大宗淡水鱼加工技术研发分中心(武汉)，武汉 430070；2.湖北省农业科学院农产品加工与核农技术研究所，农业农村部农产品冷链物流技术重点实验室，武汉 430064)

团头鲂(Megalobramaamblycephala)的养殖地主要分布在湖北和江苏等省份，其以鲜活零售为主。目前，商业上主要依靠配备氧气罐、水箱的活鱼运输车来实现鲜活团头鲂的跨地域调配。运输过程中活鱼会受到环境胁迫(拥挤胁迫、氨氮胁迫和缺氧胁迫等)，产生应激反应，进而影响肌肉品质[1]。运输过程中影响应激反应的因素包括运输时间、运输密度和运输温度等。

采用高密度运输(高鱼水质量比)可提高运输箱空间利用率，降低运输成本。但是，当鱼体处于较高生物密度的环境中，容易产生密度胁迫(拥挤胁迫)，发生应激反应，影响鱼体的生理代谢，导致免疫防御功能下降，从而影响鱼肌肉品质[2]。研究表明，高密度运输会导致水中总氨氮含量显著升高，鱼体血清皮质醇、血糖及乳酸含量显著升高[3-4]，糖原含量显著降低[4]，肌肉质构特性显著变化[5]。银鲳(Pampusargenteus)[3]和大黄鱼(Larimichthyscrocea)[4]适宜的运输密度应分别低于16 g/L和8 g/L。因此，需要从经济效益和肌肉品质两方面综合考虑适宜的运输密度。但是，关于运输密度如何影响团头鲂肌肉品质的研究还未见报道。因此，本研究模拟团头鲂活鱼运输过程，利用质构仪、光学电镜、超高效液相色谱仪等技术手段研究运输密度(鱼水质量比)对团头鲂肌肉品质的影响，以期为维持团头鲂品质提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 实验材料

团头鲂40尾，平均体长(34.50±3.01)cm、体质量(572.37±25.00)g，购自湖北省武汉市东西湖养殖基地。

1.1.2 实验试剂

无水乙醇、浓硫酸、氢氧化钠、磷酸、磷酸二氢钾、酒石酸钾钠、无水硫酸铜，均为分析纯，均购于国药集团化学试剂有限公司。甲醇、乙腈，均为色谱纯，均购买自美国Muskegon公司。乳酸、糖原试剂盒均购自南京建成生物工程研究所。次黄嘌呤(hypoxanthine，Hx)、次黄嘌呤核苷(inosine，HxR)、5′-次黄嘌呤核苷酸(5′-inosinic acid，IMP)、5′-一磷酸腺苷(adenosine-5′-monophosphate，AMP)、 5′-二磷酸腺苷(adenosine-5′-diphosphate，ADP)、5′-三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate，ATP)均为色谱纯，均购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2 仪器与设备

汽车模拟运输平台，星梭智能设备(厦门)有限公司；气体汇流排，上海擎煌贸易有限公司；氧气，武汉双龙和商贸有限责任公司；TESTO 205 pH测量仪，德图仪器国际贸易(上海)有限公司；分析天平，上海奥豪斯国际贸易有限公司；TGL-16GA台式高速离心机，湖南星科科学仪器有限公司；722型可见分光光度计，上海精密科学仪器有限公司；CR-400型色差仪，日本柯尼卡美能达公司；SD-700鱼糜弹性测定仪，日本太阳科学公司；IKA2000型高速分散均质机，德国IKA仪器设备有限公司；BS210型电子分析天平，德国赛多利斯公司；UPT-I-10/20高纯水制备仪，上海向帆仪器有限公司。Acquity UPLC-H Class超高效液相色谱仪，美国Waters公司；EclipseCi光学显微镜，日本Nikon公司。

1.3 实验方法

1.3.1 模拟运输实验

团头鲂捕捞后，随机分成4组，每组10尾，转入塑料保温箱(54.5 cm×37 cm×34.5 cm)中，按照其重量加入1.0、1.5、2.0、2.5倍重量的水，设置运输密度(鱼质量：水质量)为1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5，加入冰袋。团头鲂在2 h内运输到实验室，再转置到模拟运输平台上继续运输，在该过程中保持振动频率为120 r/min。在全程运输过程中(运输时间从捕捞后开始算起，共运输6 h)，保持水温(12±3)℃，溶氧>10 mg/L。实验中运输程序和条件参考中国运输团头鲂的商业化模式[1]。

1.3.2 取样

从4个运输箱中分别取运输密度(鱼质量：水质量)为1∶1.0、1∶1.5、1∶2.0、1∶2.5的鱼各3尾。将鱼体分割后，取自背鳍以下、侧线以上的背部肌肉。鱼肉切成20 mm×20 mm×10 mm小块，用于色度、质构分析；剩余背部肌肉一部分用于测pH、持水性、细胞结构，一部分-80 ℃冷冻，后面用于测乳酸、肌糖原、ATP及其代谢关联产物。

1.3.3 肌肉pH值测定

参考文献[6]的方法，略有改动。将插入式pH计(TESTO 205)的电极插入鱼背部肌肉中，显示屏读数即为团头鲂背部肌肉的pH值。

1.3.4 色度测定

参考文献[6]的方法，略有改动。采用CR-400便携式色彩色差计，标准白板校准，记录下L*、a*、b*。

式中：W表示样品的白度；L*值表示样品的亮度；a*值为正表示样品偏红，为负表示样品偏绿；b*值为正表示样品偏黄，为负表示样品偏蓝。

1.3.5 剪切力测定

参考文献[6]的剪切力测定方法，略有改动。团头鲂用配有刀片(直径15 mm)的小型质构仪以60 mm/min的速度，垂直肌纤维的方向切割团头鲂鱼块。将剪切力记录为测量过程中的最大力(g)。

1.3.6 持水性测定

参考文献[7]的方法，略有改动。称取约3 g样品用双层定性滤纸包裹，4 000 r/min离心15 min。以离心前后样品质量的比值表示持水性(water holding capacity，WHC)。

1.3.7 乳酸和肌糖原测定

采用南京建成生物工程研究所的乳酸和肌糖原试剂盒，按照其说明书进行测定。糖原测定波长为620 nm，乳酸测定波长为530 nm。

1.3.8 ATP及其代谢关联产物测定

样品采用超高效液相色谱仪(UPLC)进行分离鉴定，参考文献[8]的方法。在ACQUITY UPLC BEH Amide(1.7 μm，2.1 mm×100 mm，Waters)的色谱柱上进行分离。流动相组成A：乙腈，B：10 mmol/L 磷酸二氢钠，C：0.1%(V/V)磷酸水溶液；梯度体系由按A、B、C流动相不同浓度配比组成(0～6 min，88%～80% A，7%～17.5% B；6～8 min，80%～77% A，17.5%～22% B；8～9 min，77%～65% A，22%～35% B；9～10.7 min，65%～55% A，35%～45% B；10.7～10.80 min，55%～88% A，45%～7% B；10.8～23 min，88% A，7% B)。色谱分离条件设置如下：柱温50 ℃；流速0.5 mL/min；进样量5 μL。

1.3.9 细胞结构观察

参考文献[6]的测定方法，略有改动。团头鲂背部肌肉切成约10 mm×10 mm×10 mm，用4%多聚甲醛溶液固定过夜后进行石蜡切片、脱蜡、苏木精-伊红染色、脱水封片。用光学显微镜对处理好的样品进行全景扫描，并使用Pannoramic Viewer显示。采集图像的放大倍数为100倍。

1.4 数据分析

采用Origin 2021软件作图，用SAS V8软件进行分析，显著性方法为最小显著性差异法LSD(Least Significant Difference)，P<0.05。

2 结果

2.1 肌肉糖原、乳酸和pH值

不同运输密度下肌肉中糖原、乳酸和pH值含量变化如表1所示。运输密度的鱼水比从1∶2.5升高至1∶1.5时，肌糖原含量从0.85 mg/g显著减少为0.44 mg/g，乳酸从2.40 mg/g prot显著增加为3.76 mg/g prot，肌肉pH值从6.65显著下降为6.48。当运输密度继续增加至1∶1.0时，肌糖原、乳酸、pH分别增加到0.87 mg/g、4.00 mg/g port、6.54。

表1 运输密度对团头鲂背部肌肉糖原、乳酸和pH值的影响

2.2 色度

随着运输密度的升高(1∶2.5～1∶1.0)，团头鲂背部肌肉的亮度值(L*)、白度(W)先下降再增加。红度值(a*)无显著变化，蓝度值(b*)先下降后升高(表2)。当运输密度的鱼水比为1∶1.5时，团头鲂的L*值、W值最低，分别为47.24、47.20。而当运输密度的鱼水比升高至1∶1.0时，团头鲂的L*值、W值分别显著升高至50.13、50.09。

表2 运输密度对团头鲂背部肌肉色度的影响

2.3 剪切力

如图1所示，当运输密度的鱼水比为1∶2.5时，团头鲂肌肉的剪切力为398.75 g，鱼水比为1∶2.0时升高至412.78 g，但二者无显著性差异。当运输密度的鱼水比为1∶1.5时，剪切力显著下降，为348.14 g，与运输密度的鱼水比为1∶2.0时相比下降了15%。然而当运输密度继续增加到鱼水比为1∶1.0时，剪切力增加到378.50 g。结果显示剪切力随着运输密度的升高，呈现出先下降再上升的趋势。

图1 运输密度对团头鲂背部肌肉剪切力的影响

2.4 持水性

如图2所示，当运输密度为1∶2.5时，团头鲂肌肉的持水性为73.03%；1∶2.0时下降为72.51%，但二者无显著性差异。当运输密度为1∶1.5时，持水性为66.29%，与运输密度1∶2.0时相比持水性显著下降。运输密度继续增加至1∶1.0时，持水性显著上升为69.66%。结果显示，持水性随着运输密度的升高，呈现出先降低后升高的趋势。

图2 运输密度对团头鲂背部肌肉持水性的影响

2.5 ATP及其代谢关联产物

如表3可知，随着运输密度的增加，ATP、ADP、AMP的含量均无显著性变化。当鱼水比为1∶2.5时，IMP的含量为 626.46 mg/100 g。运输密度增加后，IMP的含量显著下降。鱼水比为1∶2.0、1∶1.5和1∶1.0时，IMP的含量分别为554.56、578.38、576.97 mg/100 g。HxR和Hx含量在运输密度的鱼水比为1∶2.5分别为55.22 mg/100 g和9.94 mg/100 g，它们的总量为65.16 mg/100 g。随着运输密度的增加，HxR和Hx的总量先增加后降低。在1∶1.5时，HxR和Hx总含量值最高，为153.16 mg/100 g。

表3 运输密度对团头鲂背部肌肉ATP及其关联代谢产物的影响

2.6 细胞结构

图3所示，随着运输密度的鱼水比从1∶2.5增加到1∶1.5，团头鲂肌肉细胞外间隙逐渐增大、破碎率逐渐增加。当运输密度继续增加至1∶1.0时，其细胞外间隙较1∶1.5时小，破碎率也较低。

3 讨论

3.1 肌肉糖原、乳酸和pH值

本研究结果表明，随着运输密度的增加，团头鲂肌肉糖原和pH呈下降趋势，而乳酸含量呈现增加的趋势，其原因与鱼体应激有关[1,9]。这和彭士明等[3]报道的银鲳鱼在受到更高鱼密度的拥挤胁迫后肌肉中乳酸含量升高的结果一致。乳酸、肌糖原和pH变化的原因可能是：(1)在运输过程中，鱼体之间为了空间、溶氧等竞争，导致鱼鳞脱落、鱼体损伤，并且鱼体在高密度运输过程中受到更高的拥挤胁迫后应激反应继续加剧，肌肉中储备的能量快速被消耗，厌氧糖酵解反应加快，生成乳酸后在肌肉中积累[10,11]；(2)有水活运过程中的运输箱中水质氨氮浓度上升，导致鱼体发生氨氮胁迫，肌肉pH值下降[12]；(3)由于拥挤胁迫可能会改变鱼肌肉中赖氨酸受体(RyR)的活性，使得钙大量释放到细胞质中，导致肌肉收缩加快，厌氧糖酵解加速，乳酸积累，pH下降[13]。

本研究中随着鱼水比从1∶2.5增加至1∶1.5，氨氮浓度升高速率更快、挤压碰撞频率更高，使得鱼体应激反应更强烈。并且运输过程中鱼体呼吸产生大量CO2，降低肌红蛋白和氧的结合能力，无氧消耗糖原和ATP等能量物质加剧，造成乳酸积累，从而pH下降。运输密度持续增加，能量物质消耗加快(表1)，乳酸含量继续增加[2]。在当运输密度的鱼水比从1∶1.5增加至1∶1.0时，pH有所增加。可能是由于运输密度进一步增加，虽然碰撞频率增加，但是鱼体间距离缩短导致碰撞动量降低，可能减缓鱼体应激反应。另一方面，鱼体呼吸产生大量的CO2，导致水体中CO2浓度过高。高浓度CO2对鱼类有麻醉作用，可能使鱼体处于半休眠或休眠状态[14]，此时鱼体应激反应可能减弱。所以肌糖原含量在运输密度的鱼水比为1∶1.5时最低，可能与鱼体在此条件下受到的应激强度最大有关。肌糖原的消耗与应激反应强度正相关。运输密度增加，应激反应增强，所以肌糖原的消耗量增加。而运输密度增加到鱼水比1∶1.0时，碰撞动量小、CO2浓度高，鱼体应激反应可能减弱，导致肌糖原的消耗量减少。

3.2 色度

鱼肌肉主要是以白肌为主，高品质的鱼肉洁白并具有光泽。从整体而言，随着运输密度升高，团头鲂肌肉的亮度值(L*)、白度(W)呈现下降趋势，表明高密度运输后，肌肉存在杂色和光泽度降低，并逐渐变暗。VAN等[15]研究表明，密度胁迫导致高密度的真鲷(Pagruspagrus)肌肉亮度低于低密度组，这与本研究的结果相似。高密度运输导致团头鲂色度变化可能是由于肌肉中的低pH值和ATP缺乏导致高铁肌红蛋白快速增长[16]。

3.3 剪切力

团头鲂肌肉剪切力随运输密度变化的趋势，与LEFEVRE等[17]报道的虹鳟(Oncorhynchusmykiss)在拥挤胁迫增加后肉质变软的结果基本一致。剪切力下降的原因可能主要是与肌肉结构被破坏有关[18,19]。当运输密度的鱼水比从1∶2.5增加至1∶1.5时，团头鲂肌肉细胞破裂加剧，细胞间隙变大(图3)。有研究表明在肌肉纤维细胞中表达的核转录因子NF-κB是与鱼肉质变化有关的关键调控因子，其活化水平与肉质呈显著正相关。核转录因子NF-κB活化水平易受到氨氮浓度影响[20]。因此，运输密度增加，可能增强氨氮应激对肌肉核转录因子NF-κB活性的损害，进而引起鱼肉品质劣变。

3.4 持水性

高密度运输后团头鲂肌肉处于低pH值状态，导致肌原纤维蛋白表面上净电荷数量减少，丧失肌肉部分保水能力[21]。持水性还与细胞结构有关，一般完整、均匀的细胞结构具有较高的持水性[22]。肌肉细胞结构破裂，会造成组织液流失，持水性将会下降[23]。运输密度为1∶1.5时，鱼体应激反应最激烈，造成鱼肌肉的pH最低和细胞结构显著破坏，所以此条件下持水性最低。

3.5 ATP及其代谢关联产物

实验结果中，IMP含量占最大的比重，表明该物质是鱼肉中主要核苷酸类滋味物质，与曹杰等[24]的研究结果一致。运输过程中鱼体优先消耗ATP 、ADP、AMP供能量。当这些能量中间物质含量不足时，储存的糖原逐渐降解为ATP等能量物质，以保持能量持续供应。在不同运输密度下，ATP、ADP、AMP 的消耗和合成可能处于平衡状态，因此它们含量之间并没显著性变化。随着运输密度的增加，由于应激反应加剧，更多ATP、ADP、AMP降解，造成HxR和Hx积累。HxR和Hx是苦味物质[25]，当运输密度的鱼水比为1∶1.5时，HxR和Hx的含量最高，可能是与该运输密度下应激反应最强烈有关。

3.6 细胞结构

随着运输密度的增加团头鲂肌肉细胞外间隙逐渐增大、破碎率逐渐增加。此实验现象与LEFEVRE等[17]观察到的更高鱼体密度下拥挤胁迫造成虹鳟肌纤维直径下降的结果相似。在团头鲂运输过程中，在各种环境因素的刺激下会导致鱼类产生氧化应激，进而发生脂质过氧化，细胞会释放溶酶体酶来破坏细胞膜，引起细胞破裂、组织损伤[26]，最终导致细胞发生凋亡或自噬[27]。随着运输密度增加，鱼体的挤压胁迫作用增强，可能增强鱼体应激反应。本实验结果显示，运输密度的鱼水比1∶1.5时细胞受到的损伤最大，其原因可能与该条件下受到的氧化应激行为最为强烈有关。

4 结论

研究结果表明运输密度会显著影响鱼肉的质构、色泽和滋味等品质。随着运输密度的鱼水比增加，团头鲂肌肉的剪切力和持水性先降低后升高，乳酸含量逐渐增加，苦味物质HxR和Hx的总含量先增加后降低，鲜味物质IMP先降低然后无显著性变化，说明肌肉品质先降低后升高。品质的变化原因可能主要与挤压胁迫应激对能量物质和细胞结构的影响有关。综合肌肉品质和运输成本，鱼水比为1∶1.0是较适宜的运输条件，这也与实际商业运输中采用的条件相一致。