饲料添加牛至精油对异育银鲫生长、消化酶活性、肠道组织结构及血液生化指标的影响

王俊维，丁 旺，陈 凯，谢 骏，秦 婷，潘良坤，习丙文

(1.南京农业大学无锡渔业学院，江苏无锡 214081；2.中国水产科学研究院淡水渔业研究中心，农业农村部淡水渔业和种质资源利用重点实验室，江苏无锡 214081)

异育银鲫(Carassiusauratusgibelio)生长速度快、个体规格大、易养殖，是重要的大宗淡水养殖品种，目前已经在江苏、山东以及湖北等地大面积推广养殖。近年来随着养殖环境的恶化，异育银鲫养殖病害问题多发，如大红鳃病、孢子虫病、鳃出血病[1-3]等，给异育银鲫养殖业带来了巨大压力。肠道是鱼类最大的免疫器官之一，其发挥着多种作用，例如对营养物质进行消化和吸收、抵抗病原微生物和食物抗原对机体的影响等[4]。因此，如何通过饲料途径维护养殖鱼体生理健康、增强鱼体抗病力已引起产业广泛关注。

与传统添加剂相比，中草药及其天然产物易被吸收且无残留、无污染，是一种绿色高效的水产饲料添加剂。已有研究表明，饲料中添加中草药及其提取物能够促进水产动物生长，改善水产动物消化酶活性，提高抗氧化、抗炎和抗病能力[5]。天然牛至精油是从中草药牛至中提取出的一种挥发性精油，其多以香芹酚(香荆芹酚)、百里香酚、γ-萜品烯和p-异丙基甲苯等为主要成分[6]。牛至精油在水产养殖中在抗菌[7-8]、抗氧化[9]、免疫促进[10]、促生长[11]、抗寄生虫[12]等方面具有广泛的应用。ABDEL-LATIF等[13]研究表明，添加牛至精油可以改善鲤(Cyprinuscarpio)的肠道组织形态，保护肝脏功能，提高生长性能指标和饲料利用参数。因此，为减少抗生素使用量，保障养殖品安全，在养殖过程中使用中草药来改善肠道健康已逐渐得到广泛关注并成为研究热点。

本研究以异育银鲫为对象，在基础饲料中添加不同剂量的牛至精油，探讨其对异育银鲫生长、消化酶、肠道组织结构、肝脏的影响，以期为牛至精油在水产养殖中的应用提供理论基础。

1 材料和方法

1.1 实验动物和设计

实验用异育银鲫苗种由中国水产科学研究院淡水渔业研究中心试验基地提供。牛至精油(98%)购自上海源叶生物科技有限公司。以基础饲料为空白对照组饲料，向基础饲料中添加不同含量的牛至精油制作6组饲料，添加量分别为0(空白对照)、25、50、100、200、400和800 mg/kg，基础饲料组成与营养水平如表1。

表1 基础饲料组成与营养水平(风干基础)

1.2 饲养管理

实验开始前将异育银鲫放入池塘网箱暂养，用基础饲料驯化2周后，经24 h饥饿处理后，选择规格、体质量[(37.18±0.26) g]基本一致的健康异育银鲫630尾。实验设计分为7组，每组90尾，每个组3个重复，每个重复30尾，养殖于室外2×666.7 m2池塘网箱。

投饲量为鱼体质量的2%～4%，每天投喂3次。实验期间水温25～32 ℃，pH 6.8～7.5，溶氧5～8 mg/L，氨氮<0.01 mg/L，硫化氢<0.1 mg/L。每隔2周根据鱼体质量适当调整投饲量，每日记录循环养殖池塘的水温及溶氧，观察异育银鲫的生长状态，并记录死亡情况，实验周期为8周。

1.3 样品采集与测定

1.3.1 样品采集

饲养结束后，停食24 h，对每个网箱中鱼进行称重和计数；每个网箱随机挑选10尾鱼用20 mg/L的MS-222麻醉处理后测量其体重、体长；用抗凝剂润洗的2 mL无菌注射器取尾静脉血，随即转入抗凝管中，离心收集上清液(4 ℃，2 500 r/min，10 min)，分装后-20 ℃保存备用；解剖剪取前肠用预冷生理盐水快速冲洗后用纸吸干水分，置于自封袋中-80 ℃冰箱保存备用；剪取后肠转移至4%的多聚甲醛固定液中固定备用。

1.3.2 生长指标测定

计算特定生长率(SGR)、增重率(WGR)、饵料系数(FCR)、肥满度(CF)和存活率(SR)，计算公式如下：

WGR=(Wt-W0)×100%/W0

SGR=[(lnWt-nW0)/t]×100%

FCR=Wf/(Wt-W0)

CF=Wt(g)/[L(cm)]3×100

SR=Nt/N0×100%

式中：Wt为鱼体末质量(g)，W0为鱼体初始质量(g)，t为实验天数，Wf为投喂饲料总质量(g)，L为鱼体体长(cm)，Nt为终末尾数，N0为初始尾数。

1.3.3 肠道消化酶活测定

前肠组织用0.85%的生理盐水进行组织匀浆，于4 ℃下3 000 r/min离心10 min，取上清液用于测定消化酶活性。采用福林-酚法测定胰蛋白酶活性，采用甲基试卤灵底物法测定脂肪酶活性，采用碘-淀粉比色法测定α-淀粉酶活性，具体操作按试剂盒(南京建成生物工程研究所)说明书进行。胰蛋白酶以37 ℃条件下，每分钟水解干酪素生成1 μg酪氨酸作为1个活性单位；α-淀粉酶以37 ℃条件下，每毫克组织与底物作用30 min，水解1 mg淀粉为1个活性单位；脂肪酶以37 ℃条件下，每毫克组织在反应体系中与底物反应1 min消耗1 μmol底物为1个活性单位。

1.3.4 肠道组织形态检查

取出固定过夜的后肠组织，梯度酒精脱水，二甲苯透明，透蜡，包埋，切片，37 ℃过夜烘干。苏木精-伊红(HE)染色后于光学显微镜下观察肠道组织结构，测定肠壁厚度、肠绒毛长度、肠绒毛宽度、杯状细胞数量。

1.3.5 血液生化指标检测

总胆固醇(TC)、甘油三脂(TG)、总胆红素(TBIL)、谷草转氨酶(AST)、谷丙转氨酶(ALT)等相关指标使用全自动生化分析仪BS-400-2080检测。

1.4 数据分析

实验结果用平均值±标准差(mean±SD)表示，采用SPSS 23.0软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)和Duncan氏法多重比较，统计检验P<0.05表示差异显著。

2 结果

2.1 饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能的影响

如表2所示，8周实验结束后，不同牛至精油饲料对异育银鲫SR没有显著影响。随着饲料中牛至精油添加量的增加，实验组的末均重、WGR、CP和SGR均呈上升趋势，且400和800 mg/kg组的末均重、WGR、CF和SGR均显著高于空白对照组。另外，800 mg/kg组的WGR、CF和SGR显著高于25和50 mg/kg牛至精油组。尽管室外网箱养殖实验受到养殖期间的夏季高温影响较大，造成WGR偏低和FCR普遍较高，但FCR随着牛至精油添加量的增加呈下降趋势，200、400和800 mg/kg组的FCR显著低于空白对照组。各实验组间FCR不存在显著性差异。

表2 饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能的影响

2.2 饲料添加牛至精油对异育银鲫消化酶活性的影响

由表3可知，随着饲料中牛至精油添加量的增加，胰蛋白酶活性呈上升趋势，且200、400和800 mg/kg组显著高于空白对照组。α-淀粉酶与脂肪酶活性随饲料牛至精油水平升高呈先升高再降低趋势，且均在牛至精油水平为200 mg/kg时达到最大值，并显著高于0、25和800 mg/kg组，与100和400 mg/kg组无显著差异。

表3 饲料添加牛至精油对异育银鲫消化酶活性的影响

2.3 饲料添加牛至精油对异育银鲫肠道组织结构的影响

饲料添加牛至精油对异育银鲫肠道结构的影响如表4和图1所示。与空白对照组相比，200、400和800 mg/kg组鱼体后肠的肠绒毛高度、绒毛宽度和肠壁厚度均显著性增加。800 mg/kg组鱼体后肠的肠绒毛高度和绒毛宽度显著高于50和200 mg/kg组，与400 mg/kg组无显著差异。与空白对照组相比，50和800 mg/kg组鱼体后肠的杯状细胞数量差异不显著，200和400 mg/kg组杯状细胞数量显著升高。

图1 异育银鲫后肠组织切片

表4 饲料添加牛至精油对异育银鲫后肠组织结构的影响

2.4 饲料添加牛至精油对异育银鲫血液生化指标的影响

由表5可知，TC、TBIL、TG和ALT在各实验组间差异不显著；AST活性随饲料牛至精油水平的增加而呈现下降趋势，且50、100、200、400和800 mg/kg组血液中AST含量均显著低于空白对照组，而各实验组之间差异不显著。

表5 饲料添加牛至精油对异育银鲫血液生化指标的影响

3 讨论

3.1 不同牛至精油添加量对异育银鲫生长性能的影响

目前，国内外相关研究发现饲料添加植物精油可以提高水产养殖动物的生产性能[14]。其中，牛至精油可以从多个方面促进养殖动物的生长，包括提高动物食欲、补充和完善饵料的营养水平、保持肠道菌群平衡、增强肠道上皮细胞对病原微生物的抵抗能力等[8,15]。本研究结果表明，饲料中添加牛至精油能够改善异育银鲫的生长性能。这可能归因于牛至精油及其组分作用的影响。牛至精油本身具有独特的香味，可以提高鱼体的进食欲望，从而提高饲料的摄入量和食物的适口性，改善鱼体的FBW和WGR[16]。生长性能改善的另一个可能原因是香芹酚和百里香酚的影响，它们可能刺激消化酶的分泌和酶的活性，从而促进营养物质的消化和吸收[11,17]。WALEED等[18]研究发现在低或中等养殖密度条件下，饲料中添加1 mL/kg的牛至精油能够明显改善尼罗罗非鱼(Oreochromisniloticus)的WGR、SGR和FCR。此外，DINARDO等[19]研究发现投喂添加含100 mg/L牛至精油的饲料后，欧洲鲈(Dicentrarchuslabrax)的最终体重、增重和比生长率与对照组相比均有显著的正向影响，与本实验结果相似。

3.2 不同牛至精油添加量对异育银鲫消化酶活性的影响

胰蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等是鱼体重要的消化酶组分[20]。肠道消化酶活性对饲料消化、吸收、利用均有重要影响[21]。本研究发现，与对照组相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油显著提高异育银鲫的脂肪酶、α-淀粉酶和胰蛋白酶活性，从而促进异育银鲫肠道消化吸收且中剂量添加效果更优。饲料中添加植物精油显著提高了消化酶活性，其机理可能是鱼体摄食精油后可刺激胆汁、消化道酶液分泌，提高消化酶活性，从而提高鱼体对营养的消化吸收能力[22]。ZHANG等[10]研究表明，日粮中添加牛至精油可通过增加蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶的活性水平来促进鲤的消化功能；同样，植物精油在尼罗罗非鱼[23]和海鲷(Sparusaurata)[24]上也有相同发现。因此，本研究认为在基础饲料中添加牛至精油能够显著提高异育银鲫肠道消化酶活性以及饲料消化、吸收、利用效率，进而促进异育银鲫的生长。

3.3 不同牛至精油添加量对异育银鲫肠道组织结构的影响

肠道是机体消化、营养物质吸收的重要场所，机体的消化功能与肠道发育密切相关[25]。肠道绒毛形态被认为是影响水生动物吸收能力的标志[26]。肠壁厚度的增加能够增加肠道的柔韧性、促进食物移动，进而促进肠道内营养物质的消化吸收[27]。本研究中，与对照组相比，添加200、400和800 mg/kg牛至精油显著增加鱼体后肠的肠绒毛长度、宽度和肠壁厚度。添加牛至精油的饲料通过增加肠壁厚度、肠道绒毛长度和肠道绒毛宽度来增加吸收表面积，从而改善鱼类肠道对营养物质的吸收。有研究发现从植物中提取的其他精油被证明也能增加尼罗罗非鱼[28]以及非洲鲶(Clariasgariepinus)[29]的肠绒毛长度。ASMAA等[30]的研究表明，在尼罗罗非鱼日粮中添加百里香酚后，其小肠绒毛长度显著增加。ABDEL-LATIF等[13]研究发现日粮中添加牛至精油可以显著增加肠绒毛长度和肠绒毛宽度，进而提高鲤对营养物质的吸收及消化食物的能力。牛至精油对肠道形态的改善与牛至精油的抗氧化性、抗菌性等有关[31]。有研究报道表明，牛至精油能够促进肠道有益菌如乳酸菌和双歧杆菌的生长，降低有害菌和条件致病菌的数量，减少其对肠道黏膜的损伤及用于细胞周转的能量消耗[32]。

3.4 不同牛至精油添加量对异育银鲫血液指标的影响

肝脏是机体胆固醇合成的主要场所，同时肝脏也有维持血液中胆固醇含量稳定的作用[33]；血液中胆固醇的含量能够在一定程度上反映机体肝脏的健康程度，当机体肝脏损伤时血液中胆固醇的含量往往会升高。甘油三脂同样是动物体内一种重要成分，机体能量増加通常伴随着甘油三脂含量的增加，一般情况下，胆固醇升降往往伴随甘油三脂升降[34]。此外，胆红素属于胆汁色素，总胆红素是直接胆红素与间接胆红素的总称[35]。肝细胞具有摄取胆红素的能力，能够清除血液中过多的胆红素，若机体内的胆红素超过了肝细胞的处理能力，血液中总胆红素含量便会随之升高[36]。低温胁迫会造成荷那龙罗非鱼(Oreochromishornorum)的总胆红素浓度上升，肝脏处理胆红素能力明显降低并产生代谢障碍[35]。本研究结果发现饲料添加牛至精油对异育银鲫血液胆固醇、甘油三酯和总胆红素影响不显著，表明当前添加牛至精油剂量不会对异育银鲫肝脏造成损伤。

AST和ALT是细胞线粒体中重要的氨基转移酶，广泛存在于鱼类的心脏、肾脏、肝脏、鳃等组织中[37-38]。正常情况下谷草转氨酶和谷丙转氨酶主要存在于肝细胞的线粒体中，血液中二者含量较少；而组织受损或者功能减弱时，细胞膜渗透增大，致使血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶升高[39]。因此，血液中AST和ALT的含量可以作为评价鱼类肝脏损伤程度重要指标。SEYYED等[40]研究发现百里香酚能够显著降低虹鳟(Oncorhynchusmykiss)血液中谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量，还能够降低血糖含量，减少对肝脏功能的损伤。ABDEL-LATIF等[13]报道，鲤饲料中添加牛至精油对肝功能酶没有显著影响，表明鱼类饲料中添加牛至精油对它们的肝组织没有毒性作用。本实验中，饲料中添加牛至精油能够显著降低血清AST含量，表明牛至精油可在一定程度内保护肝脏。

4 结论

本实验研究结果表明，饲料添加牛至精油对异育银鲫生长性能、肠道酶活、肠道组织结构和肝脏保护能力有明显影响。综合异育银鲫生长性能、肠道组织结构及消化酶活性和血清生化指标，建议饲料牛至精油添加量为100～400 mg/kg。