基于mTOR1信号通路研究益气凉血生肌方对人脐静脉内皮细胞缺氧/复氧损伤的保护作用

汪吴娇，刘 璐，龙 佳，鲁婷婷，杨志飞，郭伶俐，武玉泽，林 谦，万 洁

(1. 北京中医药大学东方医院，北京 100078；2. 北京市海淀区妇幼保健院，北京 100080；3. 成都市成华区中医医院，四川 成都 610051；4. 北京中医药大学东直门医院，北京 100700)

经皮冠状动脉介入治疗(PCI)是冠状动脉粥样硬化性心脏病(冠心病)的主要治疗方法之一，但PCI过程中对病变血管局部的强力机械扩张导致的内膜撕裂和损伤，随后将引发靶血管一系列复杂的生物学修复过程，而血管平滑肌细胞增生过度和血管内皮细胞损伤修复不良可导致晚期支架内再狭窄和血栓形成[1]。本项目立足于前期理论及实验研究，旨在进一步探讨益气凉血生肌方促进缺氧/复氧(H/R)损伤人脐静脉内皮细胞(HUVECs)修复的作用机制。

1 实验材料与方法

1.1实验细胞 HUVECs购自美国Sciencell公司。

1.2实验动物 健康雄性SPF级SD大鼠50只，体重330～350 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物合格证号：SCXK(京)2016-001。大鼠饲养于中国中医科学院医学实验中心动物房，恒温恒湿，无菌饲料喂养。动物处置符合相关伦理要求。

1.3药品 益气凉血生肌方组方：生黄芪30 g、丹皮10 g、丹参15 g、金银花10 g，饮片购于同仁堂；阿托伐他汀钙片(立普妥，辉瑞有限公司，国药准字H20051408，规格：20 mg×7片/盒，批号：N67207)。

1.4主要试剂 内皮细胞培养基(ECM)购于美国ScienCell公司，无糖杜氏改良Eagle培养基(DMEM)购于美国Gibco公司，胰蛋白酶(0.25%乙二胺四乙酸)购于美国Gibco公司， Western相关一抗购于美国Cell Signaling Technology公司， CCK-8试剂盒购于日本同仁化学研究所，活性氧自由基(ROS)测定试剂盒、超氧化物歧化酶(SOD)检测试剂盒、丙二醛(MDA)检测试剂盒、BCA蛋白检测试剂盒均购于南京建成生物工程研究所。

1.5实验方法

1.5.1含药血清制备 将50只SD大鼠随机分为空白组20只、益气凉血生肌方组10只、阿托伐他汀组10只、益气凉血生肌方+阿托伐他汀组10只。药物用量根据《药理实验方法学》[2]“等效剂量折算法”折算并取6.3倍等效剂量，空白组灌胃生理盐水，各药物组灌胃相应剂量药物，均1次/d，连续灌胃3 d，第4天早晨末次灌服2 h后，腹腔注射10%水合氯醛(350 mg/kg)麻醉大鼠后进行腹主动脉取血。血液室温静置2 h，3 000 r/min离心10 min，分离血清，同组血清混匀，56 ℃水浴30 min进行灭活处理，0.22 μm微孔滤膜除菌，分装保存于-80 ℃冰箱备用，避免反复冻融。

1.5.2H/R损伤内皮细胞模型建立 HUVECs用完全ECM配成1×106个/mL的细胞悬液，转种于96孔培养板中，100 μL/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。每孔细胞长至50%，用PBS液洗3次，换用无糖无血清DMEM，置于三气孵箱中(1%O2+5%CO2+94%N2)缺氧4 h，从三气培养箱中取出培养板，用PBS液洗3次，换用完全ECM，放回37 ℃ 5%CO2培养箱给予复氧16 h，建立H/R损伤模型。

1.5.3实验分组 实验共分为5组：对照组取HUVECs，加空白血清培养；模型组取H/R损伤HUVECs，加空白血清培养；生肌方组取H/R损伤HUVECs，加益气凉血生肌方含药血清培养；阿托伐他汀组取H/R损伤HUVECs，加阿托伐他汀含药血清培养；生肌方+阿托伐他汀组取H/R损伤HUVECs，加益气凉血生肌方+阿托伐他汀含药血清培养。

1.6观察指标及方法

1.6.1HUVECs增殖活性 HUVECs用含完全ECM配成1×106个/mL的细胞悬液，转种于96孔培养板中，100 μL/孔，37 ℃ 5%CO2培养箱中培养。每孔细胞长至50%。对照组HUVECs更换为空白血清培养。模型组、生肌方组、阿托伐他汀组、生肌方+阿托伐他汀组弃培养液，用PBS液洗3次，换用无糖无血清DMEM，置于三气孵箱中(1%O2+5%CO2+94%N2)缺氧4 h。从三气培养箱中取出培养板，用PBS液洗3次，各孔分别加入10%的含空白血清或相应含药血清的ECM，每组设3个复孔，放回37 ℃ 5%CO2培养箱给予复氧16 h。弃培养液，用PBS液洗3次，确定孔内无多余液体后，每孔加入100 μL ECM培养基+CCK-8溶液10 μL，37 ℃培养箱孵育约4 h，待培养液变色时，于酶标仪450 nm处测定各孔的OD值。

1.6.2ROS活性 各组细胞经相应处理完毕后，离心管收集细胞，用稀释好的DCFH-DA悬浮细胞，细胞量为1×105个/mL。将离心管放于37 ℃细胞培养箱内，孵育20 min。每隔5 min颠倒混匀一下，使探针和细胞充分接触。用无PBS洗涤细胞3次，将细胞悬液转移到96孔黑板内，用全波长扫描式多功能读数仪读板测定荧光数值。

1.6.3MDA和SOD含量 各组细胞经相应处理完毕后，吸净培养基，PBS充分洗涤细胞表面，洗去残留的培养基，胰酶消化收集细胞，用PBS洗涤3次；将沉淀细胞收集至EP管中，加入裂解液，冰浴3 min，4 ℃离心机12 000×g离心10 min，取上清用于后续检测。比色法检测MDA含量：按照试剂盒说明，将试剂盒内试剂一与样本混匀后加入试剂二应用液和试剂三应用液，涡旋均匀后，用保鲜膜扎紧试管口，用10 mL注射器针头刺一小孔，95 ℃水浴40 min后，流水冷却，3 500 r/min离心10 min，使沉淀完全，取上清100 μL，用多功能酶标仪在532 nm处检测各组吸光度值。WST-1法检测SOD活力：按照测试盒说明，将工作液和样本按照一定比例混均后，37 ℃孵育20 min，在波长450 nm处用酶标仪检测各组吸光度值。

1.6.4三磷酸腺苷(ATP)/一磷酸腺苷(AMP)质谱法检测ATP和AMP含量，计算二者比值。①色谱条件：ACQUITY UPLC BEH Amide 色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，沃特世科技有限公司，美国)。流动相(A)：50%乙腈(含5 mmol/L乙酸铵)；流动相(B)：95%乙腈(含5 mmol/L乙酸铵)。线性梯度洗脱：0～1.5 min 1% B色谱柱平衡，1.5～13 min 1%～99% B，13～16.5 min 99% B，体积流量0.3 mL/min，进样室温度10 ℃，柱温35 ℃；进样量1 μL。②质谱条件：离子源为HESI源，正负离子检测模式，鞘气：35；辅助气体积流量10；喷雾电压3.00 kV；离子传输管温度320 ℃；辅助气温度300 ℃；扫描模式：Full MS/dd-MS2，Full MS分辨率70 000，dd-MS2分辨率17 500，扫描范围m/z 70～1 050(正离子模式)和80～1 200(负离子模式)。③数据分析：采集的数据使用Tracefinder 3.2(赛默飞世尔科技公司，美国)处理，搜索本地数据库。一级质量偏差<8 ppm，二级质量偏差<15 ppm。

1.6.5哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物1(mTORC1)信号通路相关蛋白及磷酸化水平 采用Western blot法检测AMP依赖性蛋白激酶(AMPK)、雷帕霉素靶蛋白(mTOR )、p70核糖体蛋白S6激酶(p70S6K)、4E结合蛋白1(4E-BP1)表达情况：样本蛋白浓度使用BCA蛋白定量试剂盒进行定量，制备SDS-PAGE凝胶。凝胶电泳结束后，将凝胶上分离到的蛋白条带通过转移电泳方式转印至固相支持物上，然后分别用非标记一抗及辣根过氧化物酶标记的二抗对其进行孵育、检测。UVP凝胶成像分析系统采图，Image J分析软件分析灰度值。

1.7统计学方法 采用SPSS 20.0统计软件分析数据，以GraphPad Prism 6.0绘图。计量资料以均数±标准差表示，多组间比较采用one-way ANOVA方差分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1各组HUVECs增殖活性 对照组、模型组、生肌方组、阿托伐他汀组、生肌方+阿托伐他汀组的细胞增殖活性分别为0.829±0.014，0.604±0.013，0.668±0.012，0.650±0.020，0.746±0.013，模型组细胞增殖活性明显低于对照组(P<0.05)，各含药血清组均明显高于模型组(P均<0.05)，且生肌方+阿托伐他汀组明显高于生肌方组和阿托伐他汀组(P均<0.05)。

2.2各组细胞中ROS活性、MDA和SOD含量、ATP/AMP比值 与对照组比较，模型组ROS活性、MDA含量明显增高(P均<0.05)，SOD含量、ATP/AMP比值均明显降低(P均<0.05)。各含药血清组ROS活性、MDA含量均明显低于模型组(P均<0.05)，且生肌方+阿托伐他汀组ROS活性明显低于生肌方组(P<0.05)，各含药血清组MDA含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)；各含药血清组SOD含量和生肌方组、生肌方+阿托伐他汀组ATP/AMP比值均明显高于模型组(P均<0.05)，各含药血清组SOD含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)，生肌方+阿托伐他汀组ATP/AMP比值明显高于阿托伐他汀组(P<0.05)。见表1。

表1 对照组和各含药血清培养缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞中ROS活性及MDA、SOD含量比较

2.3各组细胞中相关蛋白磷酸化水平 模型组p-AMPK/AMPK明显高于对照组(P<0.05)，生肌方组、生肌方+阿托伐他汀组明显低于模型组(P均<0.05)，且生肌方+阿托伐他汀组明显低于阿托伐他汀组(P<0.05)，阿托伐他汀组与模型组比较差异无统计学意义(P>0.05)。模型组p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1均明显低于对照组(P均<0.05)，各含药血清组均明显高于模型组(P均<0.05)，生肌方+阿托伐他汀组p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K均明显高于阿托伐他汀组(P均<0.05)，各含药血清组间p-4E-BP1/4E-BP1比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见图1及表2。

图1 对照组和各含药血清培养缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞中mTORC1信号通路相关蛋白表达情况

表2 对照组和各含药血清培养缺氧/复氧损伤人脐静脉内皮细胞中mTORC1信号通路相关蛋白磷酸化表达情况比较

3 讨 论

PCI开启了冠心病治疗的新时代，药物洗脱支架与金属裸支架相比，显著降低了支架内再狭窄率，提高了随后的靶病变血运重建率，然而药物洗脱支架的广泛应用过程中也仍有几个临床相关问题尚未解决，如晚期支架血栓形成[3]和晚期支架内再狭窄[4]。目前研究发现，药物洗脱支架在抑制血管平滑肌细胞增殖和迁移、降低支架内再狭窄发生率的同时，也抑制了血管内皮细胞的增殖和迁移,延迟了血管再内皮化,从而影响了内皮伤口的愈合[5]，由此可引起迟发性支架内血栓形成[6]。廖家桢教授创新性应用中医创伤修复理论[7]，结合临床经验，拟定益气凉血生肌方，认为创伤的修复与气血盛衰有极大的关系，气虚血弱则创面愈合不良，应用内托之法则可以起到促进创面修复愈合的效果，为中医药改善冠心病患者PCI术后的预后提供了新的治疗思路。益气凉血生肌方以黄芪为君药，重用30 g，针对冠心病“气虚血瘀”的基本病机，甘温益气以行血，同时针对PCI术后病变处局部损伤“内托已溃疮疡，生肌收口”，以尽快修复损伤脉道；牡丹皮、丹参为臣，以活血之力见长，针对损伤处瘀血停滞，活血凉血化瘀，调和营气，使脉道通畅；金银花作为佐药发挥其清热解毒之功效。诸药合用，治以益气活血、凉血解毒，帮助修复脉道，整体改善患者PCI术后状态。本团队前期研究提示益气凉血生肌方可降低PCI术后联合心血管事件的发生率，有降低支架内再狭窄发生率的趋势[8]，可改善氧化应激及能量代谢障碍，抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移，促进内皮细胞损伤修复[9]。现代药效学实验证明该方中单味药物具有清除氧自由基[10]、抗氧化应激损伤[11]、改善能量代谢[12]等作用。

mTORC1信号通路是雷帕霉素调节内皮细胞和血管平滑肌细胞增殖与迁移的重要途径，氧化应激及能量障碍是mTORC1重要的上游信号。H/R损伤会导致过多的ROS生成，当ROS水平超过细胞的抗氧化能力时，细胞将遭受氧化应激损伤。氧化应激损伤的同时可以氧化细胞膜上磷脂，形成稳定的脂质过氧化物MDA。SOD是生物体内重要的防御自由基损伤酶，可清除氧自由基。大量研究表明，H/R损伤会增加细胞的基础代谢，提高细胞能量消耗量，降低细胞的能量储备水平。ATP储备水平的高低不仅直接关系着细胞正常生理功能的维持，还与细胞生长及凋亡密切相关[13]。AMPK是一种关键的能量敏感激酶，可对细胞ATP/AMP比值的变化作出反应。当缺乏能量时， ATP/AMP比值降低，诱导AMPK激活，抑制mTORC1[14]。mTORC1信号传导至下游至少两个独立靶蛋白，即p70S6K、4E-BP1，调节哺乳动物细胞生长[15]。mTORC1抑制剂能影响p70S6K和4E-BP1的活性，降低细胞周期关键因子表达量和改变其活性[16]。

本研究中，生肌方组和生肌方+阿托伐他汀组H/R损伤细胞增殖活性和细胞中SOD含量、ATP/AMP比值、p-mTOR/mTOR、p-p70S6K/p70S6K、p-4E-BP1/4E-BP1均明显高于模型组，ROS活性、MDA含量、p-AMPK/AMPK均明显低于模型组。提示益气凉血生肌方可能通过改善H/R损伤内皮细胞能量代谢，减轻氧化应激，抑制AMPK激活，调节mTORC1信号通路来发挥保护内皮细胞并促进细胞增殖的作用。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。