两种不同方法检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠的对比分析

王煌煌 王素玉 王丽 李金英 王志永

摘 要：本文探讨生化法与高效液相色谱-串联质谱法（HPLC-MS/MS）检测血清中甘氨鹅脱氧胆酸钠（GCDC）结果的相关性。根据美国国家临床实验室标准委员会（NCCLS）EP9-A文件，每天取临床样本８份，分别采用自主研发的体外诊断生化试剂和HPLC-MS/MS测定血清GCDC含量，共测定５d，记录结果，去除离群点，计算线性回归方程和相关系数，进行偏倚估计，对比生化试剂测量的准确性。通过试验得出生化法和HPLC-MS/MS方法检测血清GCDC的相关方程为Y生化法=0.9642XHPLC-MS/MS-1.2266，相关系数（r）=0.9954，两种方法结果高度相关，有很好的可比性；两种血清中GCDC检测结果具有很好的可比性，由于检测原理和仪器不同，当采用不同方法时，应对其进行对比分析和偏倚评估。

关键词：血清，甘氨鹅脱氧胆酸钠，对比

DOI编码：10.3969/j.issn.1002-5944.2023.12.058

甘氨鹅脱氧胆酸钠（Glycochenodeoxycholate，GCDC）作為一种结合型胆汁酸，其水平能直接反映出肝损伤程度。高效液相色谱法证实，通过给小鼠补充甘胺鹅脱氧胆酸钠可使其胆汁盐池人源化，此类小鼠慢性干细胞胆汁淤积单独诱导肝纤维化，继发肝损伤[1]。另有学者研究表明，GCDC处理组明显增加肝脏干细胞凋亡率[2]。在临床上测定血清中GCDC含量具有一定临床的意义。

目前，国际尚无甘氨鹅脱氧胆酸钠标准物质，临床实验室使用生化分析仪进行检测无法判定检测数据的准确度，高分辨率质谱检测准确但在临床又很难开展。为此，我们设计了生化试剂在生化分析仪上检测和HPLC-MS/MS两种不同方法同时对40例临床样本进行检测[3]，将两者数据依据美国临床实验室标准化委员会（NCCLS）批准的《用患者样本进行方法学对比及偏差评估EP-9指南文件》进行相关回归和偏倚估计，比较两种方法检测结果的一致性，同时来验证自主研发的生化试剂在生化分析仪上对临床样本检测数据的准确度。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

Agilent1260高效液相色谱仪，Agilent6460三级四级杆质谱仪（美国Agilent Technologies 公司）；电子天平（Sa r torius公司，0.1 mg）；漩涡混合器（WXW-20D，杭州齐威仪器有限公司）；台式告诉冷冻离心机（FZ-0209，湖南湘仪实验室仪器开发有限公司）；HITACHI7600全自动生化分析仪；甲醇（HPLC级，Merk）；乙腈（HPLC级，Merk）；甲酸（HPLC级，Thermo Scientific）；甘氨鹅脱氧胆酸钠对照品（纯度>97%；Merk）;甘氨鹅脱氧胆酸钠测定试剂盒（批号：220511；规格：试剂1：60 mL/瓶Ⅹ1；试剂2：20 mL/瓶Ⅹ1；研制单位：河北艾欧路生物科技有限责任公司）；校准品（批号：220511；规格：1 mL；研制单位：河北艾欧路生物科技有限责任公司）；质控品（批号：220511；规格：1 mL；研制单位：河北艾欧路生物科技有限责任公司）。

1.2 临床样本及方法

每天随机收集新鲜血清样本8份，分别用生化法（Y）和HPLC-MS/MS法（X）按顺序1～8进行标本测定，然后再反顺序8～1重复测定，连续5 d。其浓度选择按照EP-9A文件中方法对比实验数据分布建议表的要求，尽可能覆盖检测范围。

1.3 生化法测定参数设定

方法：速率法；反应时间：10分钟；反应方向：向上；主波：405 nm；副波：660 nm；样本量：3.6 μL；试剂1：243 μL；试剂2：81 μL；校准方式：2点线性。

1.4 HPLC-MS/MS方法条件

1.4.1 样品预处理

采用乙腈沉淀蛋白法处理血清：取50 μL血清于1.5 mL离心管中，加入100 μL80%乙腈溶液，漩涡振荡30 s，室温静置20 min，10，000 g高速离心20min，吸取上清液，再次高速离心20 min，吸取上清液，30℃氮气吹干，残渣用50 μL甲醇溶解，混匀，高速离心20 min，吸取上清液进样分析。

1.4.2 色谱条件

Phenomenex C18色谱柱（150 mm×2.1 mm， 3μm）；流动相：0.1% 甲酸水溶液-乙腈（50：50）；洗脱方式：等度洗脱；洗脱时间：10 min；柱温：30℃；流速：1.0 mL/min；进样量：2 μL 。

1.4.3 质谱条件

多反应检测扫描MRM 模式；ESI电离源；正离子模式；毛细管电压：4000 V；干燥气温度：300℃；干燥气流速：11 L/min；雾化器压力：15 Psi；Precursor Ion：432.2；Product Ion：414.3*（定量离子）、339.3；Fragmentor：135；Collision Energy：10；Cell Accelerator Voltage：7。

2 统计学处理

2.1 记录测定结果，做散点图及偏差图

利用Window XP Office Excel 统计软件，计算每个样本测定结果的均值（Xi和Yi），每样本两次重复测定值间差值的绝对值（DXi、DYi）及2种方法测定结果均值间的差值（Yi- Xi），Xij和Yij，j标示重复次数。

2.2 目测离群点

计算样本两次重复测定值间差值的绝对值（DXi、DYi）的平均数。计算两种方法测定结果均值间差值（Yi-Xi）的平均数。判断：对任一标本，若重复测定值差的绝对值（DXi、DYi）或两种方法测定结果均值间差值（Yi-Xi）超出平均数４倍，则检验结果视为无效。

3 谱图与结果

3.1 两种方法的结果

通過生化发反应曲线可知，该反应在6.56～8.44min之间生成物与反应时间成正比，K值3800。通过HPLC-MS/MS测定结果表明，GCDC对照品提取离子色谱图在4.68 min出锋，实际样品溶液出锋时间和对照品一致。

3.2 样本结果

生化法测定结果在0.4～23.2 μmol/L之间，每样本两次重复测定值间差值的绝对值的平均值为0.4μmol/L；HPLC-MS/MS测定结果在0.2～21.5 μmol/L之间，每样本两次重复测定值间差值的绝对值的平均值为0.13 μmol/L。

4 讨 论

本文依据N C C L S标准化文件E P- 9A对测定血清GCDC的两种方法进行了比较。其结果为：生化法和高效液相串联质谱法具有相关性，其线性回归方程为：Y生化法= 0.9 6 42X H PLC-MS /MS -1.2266，相关系数（r）=0.9954。预期偏倚在中低浓度时随GCDC浓度增高而降低，高浓度时预期偏倚在10%以下。整体结果生化法测定结果较HPLCMS/MS法测定结果偏高，高浓度时两种方法偏差在10%以下。

质谱技术以其高灵敏度，高分辨率的检测优势在生命科学领域的应用越来越广泛，为质谱的发展注入了新的活力，形成了独特的生物质谱技术。此种方法需要对血清样本进行去蛋白前处理，检测步骤较多，且检测仪器昂贵。生化法检测过程简单，是目前临床化学检验的主流方法。由于国家尚未发布甘氨鹅脱氧胆酸测定试剂盒配套的标准物质，在日常检测过程中，缺少准确度对照用标准物质。本文通过以高效串联质谱法和自主研发的生化试剂配套日立7600全自动生化分析仪，同时检测血清中GCDC含量，并对检测结果进行统计和偏倚分析，考察两种方法检测结果的一致性，为临床生化检测的准确性提供理论依据。试验结果表明两种方法相关性较高，同时本试验也表明，两种方法存在一定偏倚，尤其是在血清GCDC较低时，两种方法的检测结果偏差较大。因此，建议各临床实验室应根据本实验室的情况选择实验方法，并建立相应的实验室参考值，结合临床症状，保证实验结果的准确性，给出科学判断和解释。

参考文献

H O H E N E S T E R S ， K A N I T Z V， K R E M E R A E ， e t c .Glycochenodeoxycholate promotes liver fibrosis in mice withhepatocellular cholestasis[J]. Cells，2020，9（2）：281.

李志鹏，王健，肖程，等.胆汁淤积性微环境中甘氨鹅脱氧胆酸钠促进肝脏干细胞凋亡[J].解剖学报，2019，50（6）：747-753.

郭健，谢洁红，赵海舰.方法学比较实验的设计及对两种清蛋白测定法的比较[J].中华检验医学杂志，2000，23（6）：343-345.

作者简介

王煌煌，大专，研究方向为体外诊断试剂质量评价。

王志永，通信作者，本科，工程师，研究方向为医疗器械质量控制。

（责任编辑：刘宪银）