Edam牦牛干酪工艺优化及成熟过程中微观结构、挥发性风味物质的变化

张兰俊，张岩，陈炼红

(西南民族大学 食品科学与技术学院，四川，成都，610041)

牦牛是中国青藏高原特有的家畜，也是高原地区牧民重要的食物来源，独特的高原生存环境造就了牦牛乳汁的特异性[1]。与普通牛乳相比，牦牛乳含有更丰富的营养素，具有较大利用价值和开发潜力[2]。

Edam干酪原产于荷兰，具有独特的红色蜡封，又称“红波干酪”，其质地光滑、气味温和，咀嚼时有浓郁的乳香味[3]。Edam干酪属于浸洗硬质干酪[4]，工艺上与其他干酪最大的区别在于需要浸泡和洗涤，通过浸泡排出乳清，并用热水洗掉部分乳糖，从而减少乳酸的产生，使最终pH值在5.0～5.2[5]。Edam干酪的加工工艺在国外已经成熟，目前国内的研究中还没有用牦牛乳制作Edam干酪的先例。

干酪成熟是一个微生物发酵的过程，涉及糖酵解、脂肪分解、蛋白质水解等生化反应[6]，这些反应赋予干酪特定的组织状态、质地和风味[7]。干酪结构是由钙磷酸盐和副酪蛋白组织重叠交错连接的副酪蛋白聚合体[8]，在成熟过程中，受酪蛋白-酪蛋白、酪蛋白-水和酪蛋白-脂肪相互作用等因素的影响[9]；随着成熟时间的延长，蛋白质和脂肪发生不同程度的水解，产生一系列的风味物质，其中生成的醛、酮和醇形成了干酪特有的成熟风味[10]。成熟过程所产生的微生物菌群也可直接影响干酪风味组成[11]，任雪明等[12]优化干酪加工工艺，测定干酪挥发性风味物质主要有酮类、醇类、芳香类和烯烃类；NINGTYAS等[13]鉴定出干酪中挥发性化合物29种。

本研究采用青藏高原牦牛乳为原料，以发酵剂添加量、预酸化pH、浸洗温度、盐渍浓度作为实验因素，通过正交试验优化Edam牦牛硬质干酪工艺，表征成熟过程微观结构的变化，并采用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术(solid-phase microextraction-gas chromatography-mass spectrometry，SPME-GC-MS)分析Edam牦牛硬质干酪的挥发性风味物质，为牦牛乳开发新产品和风味分析提供理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

牦牛乳采自四川省红原县麦洼；干酪发酵剂，常州益菌加生物科技有限公司；小牛皱胃酶，丹麦Chr.Hansen公司；无水柠檬酸、CaCl2、NaCl、Na2SO4、25%戊二醛，均为食品纯，广州佳德乐生化科技有限公司。

LD1100-1R电子天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；8601手持pH计，衡欣科技股份有限公司；DZ-280/2SE小型真空封装机，广东省东莞市益健包装机械有限公司；Sigma600场发射扫描电镜，德国卡尔蔡司股份公司；GCMS-QP2010气相色谱-质谱联用仪，日本岛津公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取探针，美国Supelco公司。

1.2 试验方法

1.2.1 Edam牦牛干酪制备工艺

原料乳→过滤→标准化→巴氏灭菌→冷却→添加发酵剂→调节酸度→添加CaCl2→添加凝乳酶→凝乳→切割、热缩→排出乳清→浸洗→排出乳清→压榨成型→盐渍→干燥→封蜡→成熟

1.2.2 正交试验

在实验室原有单因素试验基础上，以发酵剂添加量(质量分数)、预酸化pH、浸洗温度、盐渍浓度(质量分数)为实验因素，采用L9(34)正交试验确定其最佳工艺方案。干酪制成后，以干酪得率和感官评分为指标，对制作成型的干酪进行评价。正交因素水平如表1所示。

表1 正交因素水平表Table 1 Orthogonal factor level table

1.2.2.1 干酪得率的测定

根据BONFATTI等[14]的方法。分别称取9组试验组所需原料乳记为m1，各组添加的CaCl2质量记为m2，凝乳酶质量记为m3，干酪压缩成型后，称其质量记为m，干酪得率(X)根据公式(1)计算。

(1)

1.2.2.2 感官评价标准

参考GB 5420—2010《食品安全国家标准干酪》感官要求制定检验方法和Edam干酪感官评价表(表2)，感官评价小组由10名来自食品科学学院受过专业训练的学生组成，对9组正交试验组分别进行评价。

表2 感官评分表Table 2 Sensory scoring table

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟过程中微观结构的变化

参考石永祺等[15]的方法。分别取3 g成熟第0、20、40、60、80天的干酪样品，沿干酪纤维方向切成光滑薄片，用2.5%戊二醛溶液浸泡固定，脱水脱脂。在-80 ℃冰箱中放置2 h后进行冷冻干燥。将干燥后的样品贴在实验台上，通过离子溅射进行镀金。置于20.0 kV电压下，在600倍电镜下扫描。

1.2.3 Edam牦牛干酪成熟过程中挥发性风味物质变化

色谱条件：载气He，流速1 mL/min，样品通过DB-Wax(30 m×0.25 mm，0.25 μm)毛细管柱。色谱升温程序：起始柱温40 ℃，保持3 min，以8 ℃/min升到100 ℃，保持2 min，然后5 ℃/min升到200 ℃，最后以10 ℃/min升到220 ℃，保持3 min。

质谱条件：电子电离(electron ionization，EI)源，电子能量70 eV，离子源温度220 ℃，四极杆温度150 ℃，扫描模式Scan，质量扫描范围m/z40～650。

1.3 数据处理

采用SPSS 25.0对实验因素A、B、C进行正交试验方差分析，每组试验重复3次，判定实验变量对实验结果的影响显著性，用Excel 2010对Edam牦牛硬质干酪实验数据进行分析。

2 结果分析

2.1 Edam牦牛干酪工艺优化结果分析

Edam牦牛硬质干酪工艺优化正交试验结果见表3。

表3 正交试验结果极差分析Table 3 Analysis of orthogonal test results

根据表3正交分析结果可得，影响Edam干酪感官评分的因素主次顺序为：发酵剂添加量>酸化pH>盐渍浓度>浸洗温度，感官评分最高的是5号干酪，为92.6分。影响Edam牦牛干酪得率的因素主次顺序为：发酵剂添加量>浸洗温度>酸化pH>盐渍浓度，即发酵剂用量对Edam干酪产量的影响最大，而盐渍浓度影响最小，干酪得率最高的是5号干酪，为19.41%。

由表4、表5的方差分析可知，发酵剂添加量、酸化pH、浸洗温度、盐渍浓度均具极显著差异性(P<0.01)。对比正交试验、极差分析和方差分析结果，正交试验的最佳工艺组合为A2B2C3D1，根据感官评价极差、方差分析的最佳工艺组合为A2B3C2D1。根据干酪得率极差、方差分析得到最佳工艺组合为A2B3C3D2。

表4 正交试验感官评分方差分析结果Table 4 Analysis of variance of sensory score of orthogonal test

验证试验：将极差、方差分析得到的最优组合即A2B3C2D1和A2B3C3D2，按照1.2.1的工艺制作干酪，计算干酪得率和感官评价。验证试验结果为：A2B3C2D1的干酪得率19.22%，感官评分86.3分；A2B3C3D2的干酪得率为19.18%，感官评分91.22分，均低于正交试验组的5号，故5号干酪A2B2C3D1为最佳制作工艺方案，最佳工艺为发酵剂添加量0.006%、pH 5.6、浸洗温度45 ℃、盐渍浓度12%。

表5 正交试验干酪得率方差分析结果Table 5 Variance analysis results of cheese yield rate in orthogonal test

2.2 Edam牦牛干酪成熟过程中微观结构观察

如图1所示，第0天时，干酪的组织结构较紧凑，酪蛋白胶束较粗，胶束之间孔径光滑且空间较小；

a-0 d;b-20 d;c-40 d;d-60 d;e-80 d图1 Edam牦牛干酪发酵0～80 d的微观结构Fig.1 Microstructure of Edam yak cheese fermentation from 0-80 d

第20天时干酪的孔径较第0天已经变大；第40天初见网状结构降解，第60天时孔径数量增多，酪蛋白胶束明显变细；第80天时酪蛋白结构分散，孔径由小变大，干酪表面变得粗糙，蛋白质分解较明显。

第0天时，干酪中的酪蛋白脂肪含量较高，且结合紧凑，所以干酪表面孔洞小；第20天时，干酪中的凝乳酶和微生物产生的酶较少，对蛋白质的降解有限；第40天时，干酪中的酪蛋白在残留的各类酶和菌作用下被水解，导致干酪的蛋白质网状结构逐渐分解，结构变得疏松，孔径变大，和杨宇[17]的研究结果一致；第60天时，微生物代谢消耗大量营养物质，干酪中的大部分蛋白质被分解成小肽和氨基酸，第80天时孔径明显变大，蛋白质分解较明显，脂类物质大量降解，干酪乳化性能变差，表面变粗糙。

2.3 Edam牦牛干酪挥发性风味物质结果分析

SPME-GC-MS技术对Edam牦牛硬质干酪不同成熟期(0、20、40、60、80 d)的挥发性风味成分进行检测，离子色谱图如图2所示。NIST-MS-Search 2.0共搜索到75个化合物，主要为羧酸类、醇类、酮类、酯类和醛类化合物。各物质的含量及其相对峰面积见表6。

a-成熟0 d;b-成熟20 d;c-成熟40 d;d-成熟60 d;e-成熟80 d图2 不同成熟时间的离子色谱图Fig.2 Ion chromatogram with different ripening time

表6 干酪成熟过程中挥发性成分的变化Table 6 Changes in volatile components during cheese ripening

续表6

续表6

从图2和表6可以看出，0 d的干酪中检测到44种风味物质，包括15种醇、15种酯、6种酮、5种醛、3种烷烃等化合物。在成熟20 d的干酪中，共检测到35种风味物质，包括1种羧酸、13种醇、6种酯、6种酮、5种醛和4种烷烃。在成熟40 d的干酪中检测到35种风味化合物，包括3种羧酸、14种醇、2种酯、7种酮、4种醛、5种烷烃等化合物。成熟60 d后，干酪中检出30种风味物质，包括5种羧酸、9种醇、2种酯、7种酮、3种醛和4种烷烃。80 d干酪中检出27种风味物质，包括5种酸、9种醇、1种酯、6种酮、3种醛、3种烷烃等化合物。

Edam牦牛干酪成熟期间各类化合物总含量及种类的变化如表7所示。利用SPME-GC-MS分析Edam牦牛干酪挥发性风味物质，不同成熟时间干酪样品中的风味物质种类和含量存在一定的差异性。实验数据显示，随成熟时间增加，挥发性化合物的种类由44种降到27种，第60天，酸类化合物含量最高，醇类化合物含量最低；第80天，酯类、酮类、醛类化合物种类及含量均下降到最低，这是由于干酪成熟过程中，蛋白质、脂肪、乳糖发生不同程度的分解同时产生不同的化合物，使得干酪的风味醇香浓厚。

表7 Edam牦牛干酪成熟期间各类化合物 总含量及种类的变化Table 7 Changes of total content and types of compounds during the ripening of Edam yak cheese

2.3.1 羧酸类化合物

干酪成熟过程中，检出的羧酸类化合物有甲酸、乙酸、丙酸、丁酸、戊酸、己酸。随着成熟时间的延长，酸类化合物的种类数量均增长；含量在第60天时达到最高值38.46%，到第80天降至26.21%，各阶段含量差异性显著(P<0.05)。这是因为干酪成熟过程中残留的乳酸菌自溶产生的胞内脂肪酶和乳酸菌释放的胞外脂肪酶共同作用生成游离脂肪酸，酪蛋白水解成多肽和氨基酸、乳糖发酵生成乳酸[18]。甲酸具有刺激性醋味，不利于干酪的风味形成[19]；乙酸和丙酸具有典型的醋酸味道；己酸具有轻微的干酪腐臭味；丁酸表现出干酪味和奶油味，但发酵过程中杂菌增多时丁酸产量升高会使干酪产生酸败气味。

2.3.2 醇类化合物

醇具有沸点低、极性低、阈值较高、对风味贡献小等特点。随着成熟时间的延长，醇类含量从68.83%降到第60天的16.90%，到第80天又升至49.6%。成熟前以丁醇为主，到第80天以苯乙醇为主。干酪中醇类物质有4种来源：乳糖代谢，甲基酮还原，氨基酸代谢以及亚油酸、亚麻酸降解。2-戊醇可表现出新鲜的干酪风味、坚果风味；己醇有椰子和浆果的味道；苯甲醇有微弱的芳香气味[20]；成熟后含量最高的苯乙醇具有玫瑰香味，对于干酪的特殊香气起到了一定作用，对干酪的风味是有利的。

2.3.3 酯类化合物

脂肪酸和醇的酯化在干酪成熟过程中起着重要作用。由于在乙酸、丁酸和己酸存在下的协同作用，酯的阈值比前体低10倍。丁酸甲酯具有苹果风味，乙基酸有水果和冰淇淋的香气，乙酸丁酯、乙酸正丙酯有一种特殊的水果香味，丁酸丙酯有香蕉和菠萝香气，己酸乙酯有菠萝味、蜡味和香蕉味[21]。

2.3.4 酮类化合物

酮是干酪中最常见的风味成分之一，具有独特的风味和较低的感知阈值。其中，最重要的挥发性成分是甲基酮。酮与原料乳的脂肪含量有关，它由多不饱和脂肪酸的氧化或热降解、氨基酸降解或通过微生物的酯解作用形成[22]。由表7可知，酮类化合物种类变化相对稳定，含量呈先上升后下降的趋势。丙酮具有特殊的辛辣气味；2-丁酮、2-戊酮的气味与丙酮类似，略带辛辣味；2-庚酮、2-壬酮赋予干酪水果味、花香味及霉腐味；己二酮具有乳脂香气。

2.3.5 醛类化合物

醛类是干酪水溶性成分中的主要挥发性化合物，也是各种氧化香精的来源。由于醛类组分化学性质相对比较活泼，很快还原成醇和相应的酸，因而醛类物质在干酪中的存留时间很短[23]。由表7可知，醛类物质种类相对稳定，含量处于动态变化中，随着脂肪氧化而逐渐增多，又因被还原成醇或酸而减少。干酪中醛类物质的来源主要有2种[24]：一是脂肪酸代谢，主要生成直链醛类；二是氨基酸转氨作用或Strecker降解，主要生成支链醛类。苯甲醛具有杏仁和坚果的风味，由色氨酸或苯丙氨酸转化而来，对干酪形成良好的风味起着重要作用；3-甲基丁醛使干酪具有强烈的气味；戊二醛和己醛具有草味和牛舍味，当含量超过一定阈值时，会产生难闻的气味。

2.3.6 烷烃及其他

烷烃化合物在干酪中随处可见。由于碳氢化合物的高阈值，风味活性较低，对干酪的呈味作用有限，其含量变化不明显，对干酪的整体风味贡献也较小。

3 结论

本试验以发酵剂添加量、预酸化pH、浸洗温度、盐渍浓度作为因素，进行正交试验，得出最佳加工工艺：发酵剂添加量0.006%、pH 5.6、浸洗温度45 ℃、盐渍浓度12%。在此工艺下制得的Edam牦牛硬质干酪成熟0～80 d，扫描电镜结果表明，随着发酵时间的延长，酪蛋白胶束变细，孔径变大，孔洞数量逐渐变少，发酵至80 d时，干酪表面变得粗糙，蛋白质脂肪分解较明显。利用固相微萃取-气相色谱-质谱联用技术对Edam牦牛硬质干酪成熟各阶段进行挥发性风味物质测定，结果表明，随着成熟时间的延长，风味化合物的总量呈下降趋势，酯类和醇类下降明显，酸类化合物的数量先增后减，第80天的主要风味物质有羧酸类和醇类；其中，生成的关键风味物质有丁酸、乙酸、戊酸、己酸、1-丁醇、苯乙醇及2-戊酮，构成了干酪的主体风味。本研究可为Edam牦牛硬质干酪加工和产品开发提供一定的参考，但干酪的风味是由挥发性成分共同作用的结果其内在机理有待进一步研究。

致谢：感谢西南大学食品科学学院实验中心张玉老师为本研究提供GC-MS检测。