人血清中葡萄糖标准物质的研制

李务荣, 杨 彬, 黄彦捷, 张 宁, 罗思婷,王 晶, 邬泉周, 武利庆

(1. 广东省计量科学研究院 广东省现代几何与力学计量技术重点实验室,广东 广州 510405；2. 广州中医药大学 中药学院, 广东 广州 510006；3. 中国计量科学研究院 前沿计量科学中心(生命科学计量研究所)， 北京 100029)

1 引 言

血清中的葡萄糖(以下简称：血糖)对糖尿病的诊断、治疗、监测具有重要意义,因此其含量测定是临床实验室频率最高的实验之一[1]。血糖作为糖尿病诊断与治疗的重要指标,其检测结果的准确与否直接影响糖尿病诊断治疗的正确性；因此,保证血糖检测量值的准确可比具有十分重要的意义。标准物质作为量值的载体,在实现量值溯源传递、保证检测结果准确可比等方面具有十分重要的意义[2～5]。

目前,常用的血清葡萄糖含量检测方法主要有氧化酶-偶联比色法、微电流法、氧速率法、己糖激酶法、邻甲苯胺法、葡萄糖脱氢酶法、微创测定法、同位素稀释液相色谱-质谱法、同位素稀释气相色谱-质谱法等[6～11]。其中,同位素稀释质谱法(IDMS)是唯一一种微量、痕量和超痕量物质量值检验的权威方法[12，13]。近年来,IDMS是最常用的临床检验量值的基准方法。通过向样品溶液中加入一种同位素标记物作为内标物,待溶质与标记物溶液充分平衡后,对样品进行预处理,利用同位素稀释-气相色谱-质谱法(ID-GC-MS)或同位素稀释-液相色谱-串联质谱法(ID-LC-MS/MS)测定标记物与溶质的峰强度比来测定溶质的浓度，该法具有特异性高、准确度高等优点。用IDMS法对血清葡萄糖浓度测定,具有特异性高、灵敏度好,不易受血清中还原性物质的干扰等特点。丁兆婷等应用同位素稀释气相色谱-质谱法对2种不同浓度血清葡萄糖进行定值,测量结果的总相对标准偏差仅为1.65%及2.24%[14]；张天娇等建立了1种使用同位素稀释液相色谱-质谱法测定血清葡萄糖的方法,国际标准物质SRM 965a的测定结果与认定值的平均偏差为-0.2%[15]。但是目前仍缺乏不同IDMS测定葡萄糖方法间的结果比照,以及对相应标准物质定值研究的报道。

本研究针对血清葡萄糖检测量值溯源传递的需求和便携式血糖分析仪检测校准的需要,研制了系列血清中葡萄糖标准物质。并采用ID-LC-MS/MS及ID-GC-MS两种方法对标准物质进行定值。该系列标准物质有望用于临床检验及相关领域对血清葡萄糖项目测量的质量评价、检测系统性能评价、实验室能力验证及相关试剂的量值传递等方面。

2 主要仪器与试剂

2.1 主要仪器

2500葡萄糖乳酸盐分析仪(美国YSI公司)；7180型全自动生化分析仪(日本HITACHI公司)；AU5800生化分析仪(美国BECKMAN COULTER公司)；气相色谱-串联质谱系统(GC-MS),GC部分为7890A(美国Agilent公司),MS部分为5975C(美国Agilent公司)；高效液相色谱-三重四级杆串联质谱系统(LC-MS/MS),包括高效液相色谱仪Agilent 1290 Infinity II(美国Agilent公司)、串联三重四极杆质谱仪6470(美国Agilent公司)和QQQ Quantitative Analysis数据处理软件；涡旋振荡器以及离心机(美国Sigma公司)。

2.2 主要试剂

GBW10062葡萄糖纯度标准物质,99.6%(中国计量科学研究院)；[13C6]葡萄糖,同位素丰度99%(美国Cambridge Isotope Laboratories)；1-苯基-3-甲基-5-吡唑酮(PMP,纯度99%)(美国Sigma)；盐酸羟胺,分析纯,99.5%(天津大茂化学试剂厂)；吡啶,分析纯,99.5%(美国Sigma)；叠氮化钠,分析纯,99%(美国Sigma)；冰醋酸,分析纯,98%,(美国Fisher)；氨水,25%,(美国Sigma)；乙酸酐,分析纯,99%(美国Fisher)；无水乙醇、乙腈、氯仿、二氯甲烷、丙酮,HPLC级(美国Fisher)。

3 实验部分

3.1 人血清中葡萄糖标准物质的制备

3.1.1 原料选取

本次血清原料是委托了生物技术服务公司从医院收集志愿者血清得到,分别使用罗氏cobas e 411免疫分析仪及希森美康HISCL-5000免疫分析仪,经化学发光试剂盒检测,HBsAg、HCV抗体、HIV抗体的检测结果为阴性,但仍不排除其潜在生物传染性,因此后续标准物质研制过程均按照二级生物安全标准防护,处理按照生物传染性样品进行。

3.1.2 浓度范围设计

根据GB/T 19634-2005《体外诊断检验系统自测用血糖监测系统通用技术条件》[16]及卫办医政发〔2010〕209号《医疗机构便携式血糖检测仪管理和临床操作规范》中规定的重复性试验用血糖浓度范围,设计6种系列人血清中葡萄糖标准物质的目标浓度覆盖1.5～28.0 mmol/L。

3.1.3 葡萄糖添加

采用基于酶膜法的YSI 2500葡萄糖乳酸盐分析仪对血清样本初步测定其血糖含量。

其中水平2为采集的正常人血清血糖浓度。

高浓度血糖样品(水平3～6)的获取：使用葡萄糖纯度标准物质配制高浓度的葡萄糖标准溶液,分别计算添加量,使用微量移液器直接加入血清中充分混匀获得。

低浓度血糖样品(水平1)的获取：将正常人血清在培养箱中37 ℃孵育约6 h,通过微生物糖降解的方式下降至所需的水平获得。

3.1.4 分装与保存

将上述侯选物经0.22 μm滤膜过滤后各分装至1.5 mL冻存管中,每管约1.0 mL,共计约300单元,置于-70 ℃冰箱中保存。

3.2 均匀性检验

采用HITACHI 7180型全自动生化分析仪对标准物质的均匀性进行检验。根据JJF 1343-2022的要求[17],每个水平的侯选物分别取出11个单元,每个单元的侯选物重复测定3次,对其进行方差分析,分析结果列于表1。

表1 系列人血清中葡萄糖标准物质均匀性数据单因素方差分析结果Tab.1 Results of one-way ANOVA on glucose reference material uniformity data in serial human serum

表1中所有水平候选标准物质的F

3.3 稳定性检验

标准物质的稳定性同样是衡量标准物质特性的1个重要参数。标准物质的短期稳定性与样品运输过程中的外部因素有关,长期稳定性与贮存条件有关。

3.3.1 长期稳定性考察

对人血清中葡萄糖标准物质稳定性进行长期稳定性考察,为期12个月。将标准物质储存于-70 ℃条件下,不同时间间隔每次取出3个样品进行稳定性考察,测试结果见图1。对所得数据进行线性回归分析,计算回归参数,并对斜率β进行t-检验,结果列于表2中。

由表2可知,6个水平的均符合|β|

图1 不同浓度水平人血清葡萄糖标准物质稳定性结果Fig.1 Results of glucose reference material stability in human serum at different concentration levels

表2 系列人血清中葡萄糖标准物质稳定性统计分析Tab.2 Statistical analysis of glucose reference material stability in serial human serum

3.3.2 短期稳定性考察

短期稳定性检验温度分别为-20、4、25和60 ℃，在各个温度下的考察时间均为7 d,不同间隔时间每次取出3个样品进行稳定性考察。首次放置样品取出1个样品保存在-70 ℃作为参考。采用与长期稳定性分析相同的方法,对所得数据进行线性回归分析,计算回归参数,并对斜率β进行t-检验。结果表明6个水平人血清中葡萄糖标准物质在-20 ℃可以稳定保存7 d；在4 ℃温度条件下水平2～水平6标准物质可稳定7 d,水平1标准物质可以稳定3 d；在25 ℃温度条件下发现6个水平的标准物质可稳定1 d；60 ℃温度条件下6个水平样本统计检验均不稳定。因此确定该系列标准物质应当在-20 ℃温度条件下进行运输为宜。

3.4 标准物质的定值

3.4.1 人血清密度测定

在20 ℃时,水的密度为0.998 62 g/cm3,以此为参比,分别对蒸馏水及人血清进行称量,根据称量蒸馏水和人血清的质量和实际体积,计算得到人血清的密度约为1.023 15 g/cm3。

3.4.2 标准溶液的配制

分别配制约1.5 mmol/L葡萄糖溶液及[13C6]葡萄糖内标溶液,混合得到标准溶液。

3.4.3 同位素稀释液相色谱-串联质谱法

(1)同位素稀释

样品中加入同位素内标后,加入适量无水乙醇,以1 500g的速度离心5 min。加入PMP-氨水衍生,70 ℃反应90 min后静置冷却至室温,加入乙酸中和反应系统；再加入等体积去离子水和氯仿,萃取后取水相上机分析。

(2)液相色谱串联质谱分析

液相色谱条件：色谱柱为ZORBAX RRHD Eclipse Plus C18柱,流动相为水(含乙酸,pH=3.5)-乙腈(75:25,体积比),流速为0.3 mL/min。

质谱条件：使用电喷雾电离源(ESI)正离子模式和多反应监测(MRM)模式,检测的离子对为m/z=511.4→175.1和m/z=517.4→175.1。

(3)定值计算

定值计算模型为

(1)

式中：C为血清中葡萄糖的浓度, mmol/L；Isam为样品中葡萄糖与内标的峰面积比(测定值)；Ilow为低标中葡萄糖与内标的峰面积比(测定值)；Ihigh为高标中葡萄糖与内标的峰面积比(测定值)；Wlow为低标中葡萄糖与内标的质量比；Whigh为高标中葡萄糖与内标的质量比；Mis为血清样品中内标的质量,mg；Mser为血清样品的质量,g；Ds为血清的密度；180.16为葡萄糖的相对分子质量。

通过测定葡萄糖与标记葡萄糖的峰面积比,可计算血清样品中葡萄糖的准确含量。每个水平血清中标准物质各取5个单元,每个单元重复测定3次,结果见表3。

表3 ID-LC-MS/MS方法定值结果

3.4.4 同位素稀释气相色谱-质谱法

(1)同位素稀释

样品中加入同位素内标后,加入适量无水乙醇,以3 000g的速度离心5 min。取上清液于60 ℃下氮气吹干。加入盐酸羟胺的吡啶溶液,90 ℃反应25 min;再加入乙酸酐,90 ℃反应25 min 后氮气吹干。加入二氯甲烷复溶,过滤后上机分析。

(2)气相色谱串联质谱分析

气相色谱条件：进样口温度270 ℃分流进样,分流比为1:40；升温程序为从125 ℃以20 ℃/min升至180 ℃,保持5 min后以3 ℃/min升至205 ℃,保持1 min后以6 ℃/min升至250 ℃,恒温5 min。载气为He气。

质谱条件：离子源温度200 ℃；传输线温度270 ℃；电离方式为70 eV EI；发射电流为0.2 mA；采集方式为SIM选择离子监测,双通道m/z=314和319。

(6)定值计算

计算模型与ID-LC-MS/MS法一致。每个水平血清中标准物质各取5个单元,每个单元重复测定3次,结果见表4。

表4 ID-GC-MS方法定值结果Tab.4 Result of ID-GC-MS method

3.4.3 两种定值方法分析

在ID-LC-MS/MS方法中,检测使用的母离子质荷比为511及517,其分子量差为6,与天然葡萄糖及标记葡萄糖的分子量差相同。然而ID-GC-MS方法中,检测使用的母离子质荷比为314及319,2者差为5。对这一现象进行了具体探讨,ID-LC-MS/MS衍生化产物分子式为C26H30N4O7,其相对分子质量为510.41。若使用同位素标记的葡萄糖进行衍生化,得到的产物分子式为13C612C20H30N4O7,其相对分子质量为516.41[8]。ID-GC-MS衍生化过程涉及的反应如图2所示。

得到的衍生化产物分子式为：C16H21NO10,其相对分子质量为387.34。若使用同位素标记的葡萄糖进行衍生化,最终得到的衍生化产物分子式为13C612C10H21NO10,其相对分子质量为393.34。衍生化产物在质谱中主要发生碎片的断裂过程(脱去了原本属于葡萄糖分子中的1个C)如图3所示。

图2 ID-GC-MS方法葡萄糖衍生化过程Fig.2 Glucose-derived process in ID-GC-MS method

图3 ID-GC-MS方法葡萄糖衍生物裂解过程Fig.3 The Glucose-derivative cleavage process in ID-GC-MS method

对于天然葡萄糖衍生化产物,主要碎片离子峰的分子式为C13H14NO8,其相对分子质量为313.26；对于同位素标记的葡萄糖衍生化产物,主要碎片离子峰的分子式为13C512C8H14NO8,其相对分子质量为318.26。使用电子轰击源(EI)正离子模式和单离子检测扫描(SIM)模式分析,检测的离子为m/z=314,387(天然葡萄糖)和m/z=319,393([13C6]葡萄糖)时,m/z=387及393的保留时间较短,且峰面积仅为m/z=314及319的1%,说明衍生化产物在该质谱条件下不能稳定存在,检测m/z=314及319的碎片离子峰更为稳定。

由此可见,虽然2种同位素稀释质谱方法中分子量差不同,但2种方法均是准确可靠的,且经方差齐性检验及独立样本t-检验,证明方法间方差齐性且等精度,在统计学上没有显著性差异。根据JJF 1006-1994《一级标准物质技术规范》,将全部数据视为1组新的测量数据,计算全部原始数据的总平均值和标准偏差,结果详见表5。

3.5 标准物质不确定度评估

系列人血清葡萄糖标准物定值结果的不确定度来源于定值过程中引入的不确定度、标准物质均匀性引入的不确定度、短期稳定性和长期稳定性引入的不确定度。定值过程中引入的不确定度分量包含溶液的配制(标准溶液及同位素标记溶液)、血清样本的稀释、密度测定及纯度标准物质等分量。各不确定分量的评定结果见表6。表6中u11，u12，u13合成得u1；u1，u2，u3，u4合成得uc。

表5 系列血清中葡萄糖标准物质定值结果Tab.5 Results of glucose reference material in human serum mmol/L

3.6 标准物质的基质效应评估

基质效应是各种临床检验质量保证中的常见问题。在量值溯源中,其存在限制了某些参考物质、校准物和质控物的直接使用,影响了结果的准确性。由于临床检验的标准物质在使用中可能受基质效应的影响,对评价指标(特别是靶值)的设定将带来诸多问题。因此在应用标准物质之前,需要考察它们对常规测量过程是否存在基质效应,这是量值溯源的重要前提。

临床中,葡萄糖的测定方法主要有己糖激酶(HK)法和葡萄糖氧化酶(GOD)法。因此分别选用2种常规分析系统,HK法采用BECKMAN COULTER AU5800生化分析仪,GOD法采用YSI 2500葡萄糖乳酸盐分析仪,分别测试31份新鲜临床病人血清样本,对该系列标准物质的基质效应进行评估，结果如图4、图5所示。评估方法的测定均值均在y值的95%置信区间内,说明研制的系列人血清中葡萄糖标准物质对不同常规分析方法均无基质效应。

4 结 论

应用ID-LC-MS/MS法和ID-GC-MS法2种方法研制了6种不同浓度血清葡萄糖标准物质进行定值,定值结果分别为：(1.70±0.04) mmol/L；(6.61±0.15) mmol/L；(9.78±0.23) mmol/L；(14.02±0.32) mmol/L；(19.06±0.41) mmol/L；(28.12±0.58) mmol/L。该系列标准物质具有良好的均匀性,且在-70 ℃的保存条件下稳定12个月,在多种常规分析系统上无明显的基质效应。该系列标准物质填补了临床葡萄糖检测溯源参考系统的空白,弥补了GB/T 19634-2005《体外诊断检验系统自测用血糖监测系统通用技术条件》等国家标准在执行过程中高、低极值点的准确度评价没有标准物质支撑的短板。该系列标准物质可用于检测校准、质量控制等方面,有望在糖尿病的临床诊断中发挥重要作用。

表6 系列血清中葡萄糖标准物质不确定度评定结果Tab.6 Results of glucose reference material uncertainty evolution in human serum

图4 BECKMAN COULTER AU5800生化分析仪测定结果Fig.4 Results of BECKMAN COULTER AU5800 biochemical analyzer

图5 YSI 2500葡萄糖乳酸盐分析仪测定结果Fig.5 Results of the YSI 2500 glucose lactate analyzer