补骨脂酚对链脲佐菌素诱导的大鼠糖尿病心肌病保护机制研究

康永建 郑权友 王兮

1.陆军第九五八医院麻醉科，重庆 400000；2.陆军第九五八医院泌尿外科，重庆 400000；3.陆军第九五八医院呼吸内科，重庆 400000

糖尿病是一种以长期高血糖为特征的慢性内分泌代谢性疾病，心脏损伤是其主要并发症和死亡原因之一[1]。高血糖引起的糖尿病心肌病，是指在无高血压、无明显器质性疾病的情况下，心肌功能障碍的一种特殊形式[2]，其发展缓慢并隐匿，病理特征表现为心肌细胞凋亡，间质纤维化及左室功能障碍[3]。补骨脂酚是一种具有生物活性单萜苯酚，可从豆科植物补骨脂的种子获得[4]。近来研究表明，补骨脂酚具有广泛的药理学作用，包括抑菌、抗感染、抗衰老、抗肿瘤等效应[5-9]。研究指出，补骨脂酚可抑制脂多糖引起的心肌细胞凋亡[10]，但其能否预防糖尿病心肌病引起的心肌凋亡鲜见报道。本研究采用糖尿病心肌病大鼠，探讨补骨脂酚对糖尿病心肌病的保护作用及其信号通路。

1 材料与方法

1.1 实验材料

选取45 只8 周龄雄性SPF 级SD 大鼠（体重180～220 g），由陆军军医大学动物实验中心提供，动物生产许可证号：SCXK（渝）20170002。经实验动物福利伦理审查委员会审核通过（AMUWEC9031）。45%高糖高脂饲料（high sugar and fat diet，HFD）（南通特洛菲饲料科技公司）；BAK（Sigma-Aldrich-SMB00604）；链脲佐菌素（Sigma-Aldrich-S0130）；TUNEL（Roche-11 684809910）。DAPI（Sigma-Aldrich-D9542）。兔抗Bcl-2抗体（Proteintech-26593-1-AP），兔抗Bax 抗体（CST-14796），兔抗caspase-3 抗体（CST-9662），兔抗Cleaved caspase-3 抗体（CST-9661）及鼠抗β-actin 抗体（CST-3700），辣根过氧化物酶标记的二抗山羊抗兔（Proteintech-SA00001-4）、山羊抗鼠抗体（Proteintech-SA00001-1）。使用仪器包括：超高频分辨小动物超声成像系统（Visual Sonics，Vevo 2100），高分辨率显微镜（ZEISS，X-Cite SERIES-120Q）。苏木精-伊红染色试剂盒（C0105S）及4%多聚甲醛（P0099-500 ml）购于上海碧云天生物技术有限公司，Masson 染色试剂盒（BSBA-4079A）购于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.2 研究方法

1.2.1 动物分组和处理 将45 只大鼠按照随机数字表法分为三组，每组15 只。①糖尿病组[11]：HFD 饮食4 周后每日腹腔注射链脲佐菌素（50 mg/kg），持续注射3 d 后，检测随机血糖≥16.7 mmol/L 认为建模成功，继续HFD 喂养8 周；②补骨脂酚组：造模方法与糖尿病组相同，建模成功后，继续HFD 饲料喂养8周，每天灌胃摄入补骨脂酚（60 mg/kg）至观察终点；③对照组：正常饮食4 周后连续3 日腹腔注射生理盐水，继续正常饮食8 周。糖尿病组、补骨脂酚组动物均建模成功，干预期间三组动物未出现死亡。

1.2.2 糖耐量实验 链脲佐菌素腹腔注射1 周后，三组空腹12 h 经口予葡萄糖（2 g/kg）。在0、30、60、90、120 min 记录血糖值，绘制折线图。

1.2.3 心脏超声 三组行吸入麻醉（3%异氟烷）后备皮，仰面置于温控台，power Lab 数据采集分析系统监测心率。利用超高频分辨小动物超声成像系统Vevo 2100 评价三组心脏功能。

1.2.4 心肌苏木精-伊红染色、Masson 染色及TUNEL染色检测 取大鼠心脏，PBS 洗净后固定于4%多聚甲醛24 h。常规脱水，石蜡包埋，切片，脱蜡。按苏木精-伊红染色和Masson 染色试剂盒步骤进行染色、封片，普通光镜观察并拍照。标本常规脱蜡后，按TUNEL试剂盒说明书行心肌凋亡检测。20 倍镜下随机选择5 个以上不重复的视野，统计心肌细胞凋亡指数。

1.2.5 蛋白免疫印迹法检测凋亡相关蛋白PBS 将大鼠心脏灌洗干净，-80℃冰箱保存。取各组心脏组织研磨，加入裂解液，提取蛋白。BCA 法测定各组样本蛋白浓度后加入缓冲液调整各组蛋白浓度一致。采用SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜至PVDF 膜。牛奶封闭后，按1∶1 000 稀释相关蛋白（Bcl-2、Bax、Cleavedcaspase-3、caspase-3）1∶5 000 稀释β-actin 作内参孵育一抗12 h。TBST 洗脱后孵育二抗1 h，再使用TBST洗脱。最后通过蛋白质印迹法成像系统显影。

1.3 统计学方法

选择Prism Graphpad 软件行统计学分析，计量资料采用均数±标准差（）表示，比较采用t 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 三组血糖及心功能指标比较

糖尿病组各时间点血糖曲线下面积高于对照组，心脏左室射血分数、左室短轴缩短率低于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。补骨脂酚组各时间点血糖曲线下面积低于糖尿病组，左室射血分数、左室短轴缩短率高于糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05 或P＜0.01）。见图1。

图1 三组血糖及心功能指标比较（n=15）

2.2 三组心脏组织病理改变

糖尿病组心肌排列紊乱，血管周围胶原纤维明显增多，补骨脂酚组心肌紊乱现象改善，血管周围胶原纤维明显减少。见图2。

图2 三组心脏组织病理改变（bar=50 μm）

2.3 三组心肌细胞凋亡情况及相关蛋白表达水平比较

糖尿病组Bcl-2 低于对照组，心肌细胞凋亡指数、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax 表达水平高于对照组，差异有高度统计学意义（P＜0.01）。补骨脂酚组心肌细胞凋亡指数、Cleaved caspase-3/caspase-3、Bax、Bcl-2 表达低于糖尿病组，差异有统计学意义（P＜0.05）。见图3～4。

图3 三组心肌细胞凋亡指数比较（n=5）

3 讨论

据测算，2045 年全球糖尿病患者将超过6亿[12]，糖尿病心肌病为其重要致死性并发症之一[13-14]。目前治疗方案主要基于标准心力衰竭药物和口服抗糖尿病药[15]，临床亟须针对糖尿病心肌病的药物。补骨脂酚作为一种具有生物活性的提取物，可改善糖尿病引起的心肌组织氧化应激损伤[16-18]。本研究结果显示，糖尿病大鼠8 周后心功能降低，心肌出现纤维化，给予补骨脂酚可有效改善心功能，减轻心肌组织纤维化，具体保护机制与其抗心肌细胞凋亡有关。

细胞凋亡由两种途径组成，即外源性和内源性凋亡，心肌细胞凋亡是糖尿病心肌病重要机制之一，因此抑制心肌细胞凋亡在糖尿病心脏保护领域极具意义[19]。研究发现，内源性凋亡在糖尿病心肌病的进展中发挥重要影响。内源性细胞凋亡是由线粒体外膜通透性启动的[20-21]，线粒体外膜通透性受到Bcl 家族的严格控制，其中就包括了抗凋亡蛋白Bcl-2[22]、促凋亡蛋白Bax[23]，而抗凋亡机制的失衡最终会导致caspase-3 激活，出现凋亡形态小体[24-25]。抑制糖尿病心肌细胞过度凋亡，已成为治疗糖尿病心肌病的重要干预策略。本研究进一步检测发现，补充补骨脂酚可抑制糖尿病心肌细胞凋亡信号通路，降低Bax 及Cleaved caspase-3 蛋白表达，从而保护心功能。本研究存在一定的不足：①研究所采用的糖尿病模型，未设置阳性药物组。②未设置补骨脂酚浓度梯度给药组。本研究只采用了主流剂量给药，虽得到阳性结果，但对不同浓度药物的保护效果观察存在缺失，后续将进一步完善实验设计。

图4 三组心肌凋亡相关蛋白表达水平比较（n=5）

综上所述，本研究发现补骨脂酚可显著抑制糖尿病引起的心肌细胞凋亡通路，减少凋亡，改善心功能，为补骨脂酚相关药物的开发和临床研究提供了实验依据。