达乌里芯芭质量综合评价方法研究

白硕雅 王秀梅 娜布其 其乐木格 辛 颖 王青虎

内蒙古民族大学蒙医药学院，内蒙古 通辽 028000

达乌里芯芭CymbariadahuricaL.为玄参科芯芭属多年生草本植物，分布于中国黑龙江、内蒙古、河北等省区。其味微苦，性凉，具有燥 “希日乌素”，清热、止痛、止痒、消肿、止血等功效，用于治疗类风湿关节炎、黄水疮、皮肤瘙痒、阴囊瘙痒、阴道瘙痒症、肿块、外伤出血等症[1-2]。文献[3-7]报道达乌里芯芭主要化学成分有环烯醚萜及其苷、苯丙素苷、黄酮类、单萜、倍半萜及有机酸等。对达乌里芯芭质量控制方面进行研究，刘淑贞等[8]以木犀草素为对照品，采用TLC法建立了芯芭的真伪鉴别方法，邬国栋等[9]以C8柱为固定相，以0.1%磷酸水-甲醇(99∶1)流动相，采用高效液相色谱法测定芯芭中梓醇的含量，乌仁曹布道等[10]采用高效液相色谱法建立芯芭中6个环烯醚萜苷的含量测定方法，但按药材质量评价体系向多指标成分综合评价发展要求，现已建立的达乌里芯芭质量控制方法无法有效地评价达乌里芯芭的内在质量。本文拟将按照2020版《中国药典》质量标准内容要求，建立达乌里芯芭定性定量方法，补充一般检查项目，为综合评价达乌里芯芭的质量控制提供可靠依据。

1 仪器与材料

1.1 仪器 高效液相色谱仪 (Agilent 1260 Quat Pump VL输液泵，1260 DAD WR检测器，LC OpenLab CDS 2工作站，1260 MCT柱温箱)；AUW220D型电子天平(日本岛津)；超声KQ-600DB型波冲洗器(昆山市超声仪器有限公司)；纳氏比色管(天津市奥淇洛谱商贸有限公司)；砷盐检查装置(泰州市康之达实验器材有限公司)；水分测定仪(北京若水合科技有限公司)。

1.2 材料 硅胶G(上海海洋化工厂)；标准砷溶液(100 μg/mL，批号：20200720，北京北方伟业计量技术研究院)；甲醇、乙腈(Fisher Scientific Inc, United States)；超纯水为自制；其它试剂均为分析纯。对照品：梓醇、桃叶珊瑚苷、8-表番木鳖和益母草苷均为自制，纯度均大于98%以上。不同批次达乌里芯芭采集信息见表1，经内蒙古民族大学蒙医药学院药用植物鉴定教研室红艳副教授鉴定均为正品。

表1 达乌里芯芭采集信息表

2 方法与结果

2.1 TLC鉴别

2.1.1 样品液制备 称取12批样品粉末各2.0 g，放入锥形瓶(50 mL)中，加二氯甲烷(20 mL)，用超声波清洗器处理30 min，过滤，药渣自然晾干后加甲醇(20 mL)，超声波清洗器处理30 min，过滤，滤液浓缩至10 mL，即得样品液。

2.1.2 对照液制备 称取益母草苷、梓醇和8-表番木鳖对照品适量，用甲醇配成10 μg/mL的对照液。

2.1.3 TLC条件 益母草苷和梓醇∶吸附剂为硅胶G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂。8-表番木鳖∶吸附剂为硅胶G，以三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)为展开剂，以10%硫酸乙醇溶液为显色剂。

2.1.4 TLC展开、显色及分析 吸取12批样品液20 μL和对照液8 μL点于同一硅胶板(长和宽为20 cm×10 cm, 厚度为2 mm)上，展开，取出，晾干，10%硫酸乙醇溶液显色，结果如图1～3所示。从图1～3可知，在实验优化的薄层色谱条件下，供试液中与益母草苷、梓醇和8-表番木鳖对照品Rf值相同斑点存在，并其Rf值合理、斑点清晰、重现性好。

S.对照液；1～12.样品液图1 益母草苷的TLC图

S.对照液；1～12.样品液图2 梓醇的TLC图

S.对照液；1～12.样品液图3 8-表番木鳖的TLC图

2.2 一般检查

2.2.1 重金属检查

2.2.1.1 供试液制备 按2020版中国药典有机破坏-硫代乙酰胺法项下，取本品粉末4.00 g，重金属检查要求处理，制备供试液。

2.2.1.2 标准铅溶液制备 按有机破坏-硫代乙酰胺法要求，制备标准铅贮备液。实验开始前，用标准铅贮备液配成浓度为10 μg/mL的标准铅溶液。

2.2.1.3 检查方法 分别吸取12批供试液和标准铅溶液2.0 mL，放入纳氏比色管中，依有机破坏-硫代乙酰胺法项下进行检查，结果显示供试液产生的颜色均浅于标准液，说明符合中国药典的要求(含重金属不得过10 mg/kg)。

2.2.2 砷盐检查

2.2.2.1 供试液制备 按2020年版《中国药典》古蔡氏法项下，取本品4.0 g，按古蔡氏法要求进行有机破坏并制备供试液。

2.2.2.2 标准砷溶液制备 实验开始前，将标准砷溶液稀释成浓度为1.0 μg/mL。

2.2.2.3 检查方法 吸取12批供试液各12.5 mL和标准铅溶液(1.0 μg/mL)2 mL，放入A瓶中，依古蔡氏法进行检查，结果(如图4所示)显示12批供试液产生斑点的颜色均浅于标准液，说明符合中国药典的要求(含砷量不得过10 mg/kg)。

S.标准铅溶液；1～12.供试液图4 砷盐检查结果图

2.2.3 水分测定 按2020年版《中国药典》甲苯法水分测定要求，分别称取12批供试品20.0 g，置于圆底烧瓶中，加甲苯适量，连接好水分测定装置，加热10 h，冷却分层后读出水分体积，计算其水分含量，结果见表2。如表2所示，12批供试品中水分含量变化在4.96 %～6.97 %。

表2 12批样品中水分、灰分及浸出物测定结果 (n=3)

2.2.4 灰分测定 称取12批供试品适量，经马弗炉有机破坏，按2020年版《中国药典》灰分检查项下进行总灰分与酸不溶性灰分的测定，结果见表2。如表2所示，12批供试品中灰分量变化在8.36%～13.10 %，而酸不溶灰分在1.16%～ 9.01%。

2.2.5 浸出物检查 按2020年版《中国药典》热浸法项下要求，用水、乙醇作为溶剂进行测定，结果见表2。如表2所示，12批供试品中水溶性浸出物含量变化在24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

2.3 含量测定

2.3.1 溶液制备

2.3.1.1 样品液制备 12批次达乌里芯芭药材粉末(过 60 目筛)各1.0 g，精密称定，分别置于具塞锥形瓶(50 mL)中，加20 mL甲醇，超声 30 min，过滤，滤液上加入活性炭1.0 g，放置2 h，过滤，滤液用 0.45 μm 有机微孔滤膜过滤，即得供试液。

2.3.1.2 对照品储备液制备 精密称取梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷对照品各10 mg，分别加甲醇10 mL配成1.00 mg/mL的梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷对照品储备液。

2.3.2 色谱条件 色谱柱：Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色谱柱(250 mm×4.6 mm, 5μm)；流动相：乙腈(A)-水(B)；梯度洗脱，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%；检测波长：210 nm；流速：1.0 mL/min。在上述色谱条件下，梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷的系统适用性试验结果显示，分离度(R)大于1.5，达到基线分离效果，理论塔板数(n)均不低于7000，其HPLC图(如图5所示)。

A.样品液；B.混合对照液；R1.梓醇；R2.桃叶珊瑚阿苷；R3.益母草苷图5 样品液和混合对照液HPLC图谱

2.3.3 标准曲线绘画及检测范围确定 利用微量移液器精密吸取梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷对照品储备液适量，分别置于量瓶(10 mL)中，用甲醇配成梓醇的浓度为0.50 mg/mL，而桃叶珊瑚阿苷和益母草苷的浓度为0.20 mg/mL，在“2.3.2”项下色谱条件下进行测定，进样量分别为2.5 μL、5 μL、7.5 μL、10 μL、12.5 μL、15 μL，计算其回归方程式。结果见表3。

表3 线性关系结果

2.3.4 精密度试验 在上述色谱条件下，连续进梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷对照品溶液6次，计算梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷峰面积的相对标准偏差(RSD)，分别为0.61%、0.72% 和0.59 %，表明仪器精密度较好。

2.3.5 稳定性试验 用液相进样针吸取同一供试品溶液(TZ1)10 μL，在上述色谱条件下，分别于0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h进样，测得峰面积，计算梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷相对含量的RSD，分别为1.2 %、0.76%和1.3 %，表明供试品溶液在12 h内基本稳定。

2.3.6 重复性试验 称取同一供试品(TZ1)6份，每份1.0 g，精密称定，照“2.3.1.1”项下制备样品溶液，进样测定，计算梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷相对含量的RSD分别1.4 %、1.2 %和1.5 %。

2.3.7 加样回收率试验 取供试品(TZ1)0.50 g，共 6 份，精密称定，按样品中原有量与对照品加入量的比例为1∶1的要求分别加入梓醇、桃叶珊瑚阿苷和益母草苷对照品适量，按“2.3.1.1”项下供试品溶液的制备制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率和RSD。结果见表4。

2.3.8 样品测定 取 10批样品各适量，分别按“2.3.1.1”项下方法制备供试品溶液，再按“2.3.2”项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量。结果见表5。

表5 样品含量测定结果 (mg/g，n=3)

3 讨论

薄层色谱鉴别时，石油醚-乙酸乙酯-甲酸，环己烷-丙酮-甲酸及三氯甲烷-甲醇-甲酸等不同梯度展开系统对益母草苷、梓醇和8-表番木鳖的影响进行了考察。当益母草苷和梓醇的展开剂为三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶6∶1)、8-表番木鳖的展开剂为三氯甲烷-甲醇-甲酸(14∶7∶1)时，益母草苷、梓醇和8-表番木鳖的的斑点清晰、Rf值合理和分离度好。按2020版中国药典各检查项下要求，开展了重金属检查、砷盐检查、水分测定、灰分测定及浸出物检查等项目。从表2可以看出，12批达乌里芯芭中重金属、砷盐、水分均符合中国药典标准。12批达乌里芯芭中总灰分在4.91%～ 8.36%，而酸不溶灰分在1.16%～8.39%。12批芯芭中水溶性浸出物24.50%～41.18%，而醇溶性浸出物在19.56%～35.25%。

实验对流动相乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸水及甲醇-磷酸水等二元梯度洗脱系统进行了考察，结果乙腈(A)-水(B)，梯度洗脱，A：0～13 min，15%～25% ；13～20 min，25%～45%为流动相时，被检测成分梓醇、益母草苷和桃叶珊瑚阿苷的分离度效果好，分析时间合理。分梓醇、益母草苷和桃叶珊瑚阿苷在200～400 nm范围内进行扫描，在210 nm处均最大吸收。

从表3可以看出，梓醇、益母草苷和桃叶珊瑚阿苷的线性关系(r>0.9993)在较宽的浓度范围内表现出良好。从精密度、稳定性和重复性实验结果得出，该方法的精密度、稳定性和重复性均较好，RSD均小于2.0 %；从表4看出，梓醇、益母草苷和桃叶珊瑚阿苷的平均回收率在96.53 %～97.27 %范围内，RSD也均小于2.0 %。从表5看出，梓醇、益母草苷和桃叶珊瑚阿苷在不同批次达乌里芯芭中相对含量变化分别为(10.32±0.13)～(11.81±0.16)、(4.03±0.05)～(4.91±0.07)、(2.54±0.03)～(2.93±0.05)mg/g。

综述，通过本实验研究，建立了达乌里芯芭的质量综合评价体系，为该药材的质量控制提供了有力依据。