氧化应激影响膀胱梗阻性疾病分子机制的研究进展

汪松，杨亚飞，何江枢，李嘉，龙军 综述 陈林，陈书练，梁国标，杨进 审校

1.遵义医科大学，贵州 遵义 563000；2.成都大学附属医院泌尿外科，四川 成都 610081

膀胱出口梗阻(BOO)在老年人下尿路疾病中普遍存在，其中最常见的疾病是良性前列腺增生。膀胱出口长期的梗阻会使得膀胱的组织结构发生变化，功能减退，甚至最终导致肾脏功能障碍。其早期的临床表现为尿频、尿急、夜尿、尿流变细、尿后滴沥及尿不尽等下尿路症状，这会导致生活质量的下降，如下腹部不适、尿失禁、睡眠质量下降甚至失眠。

氧化应激是体内的一种偏向于氧化的状态，主要与氧化系统和抗氧化系统作用失衡有关。氧化系统包括活性氧(ROS)、活性氮(RNS)和自由基，如超氧阴离子自由基(O2-)、羟基自由基(OH)以及非自由基，如过氧化氢(H2O2)、一氧化氮(NO)、过氧硝酸盐及次氯酸，在一些疾病状态下这些分子在细胞水平会升高。ROS和RNS等物质的产生过多会引起多种损伤，主要包括DNA 的损伤、脂质分子的过氧化以及一些蛋白质合成过程中修饰的改变，此外还能引起线粒体的损伤[1]。损伤的线粒体反过来又产生大量的活性物质，形成恶性循环，同时这些物质会通过多种途径促进炎症的发生[1]。此外，活性氮物种(RNS)在某些生理和病理条件下起着至关重要的作用，包括心血管系统和恶性肿瘤[1-2]。在生理条件下ROS 和RNS 能够调控增殖、凋亡、分化、迁移和代谢的过程，然而过量则产生会引起氧化应激，这将导致各种病理状况，包括癌症、糖尿病和心血管疾病[1]。

在多种尿路疾病引起的膀胱出口梗阻中，已有多种动物模型证实了膀胱中血流的减少和缺血缺氧[3]，并引起膀胱功能和结构的变化，产生一系列下尿路症状。近年来的研究证实缺血和缺氧以及再灌注引起的氧化应激是引起膀胱功能和结构障碍的重要因素，然而其导致膀胱改变的机制的研究还比较局限，因而这一主题对于了解膀胱出口梗阻的病因和致病机制至关重要。除此之外，对膀胱疾病中的氧化应激相关知识的了解为相关疾病的潜在治疗策略的研究提供了重要的条件。

1 膀胱组织中的氧化应激

随着对膀胱出口梗阻相关疾病的深入研究，大量的证据表明了缺血缺氧在膀胱梗阻性疾病中发挥着重要的作用。BOO 引起的尿液潴留和膀胱压力的增加对膀胱壁产生周期性的机械挤压，膀胱平滑肌为了克服压力的增加而代偿性的肥大和增生。增生的平滑肌和周期性的收缩与舒张使得膀胱供氧不足，并发生周期性的缺血和再灌注，这一病理过程将导致膀胱组织结构的变化和功能障碍，有证据表明其机制与氧化应激的增加密切相关[3]。长期的缺血/再灌注产生大量的ROS，过多的ROS 诱导氧化应激的产生，通过引起脂质的过氧化、DNA 和线粒体的损伤，一方面导致膀胱组织的损害，另一方面抑制了膀胱能量的产生，进而抑制了膀胱平滑肌的收缩[4]。除此之外ROS及其诱导的氧化应激激活了多条信号通路，在BOO的慢性进展过程中发挥了重要作用。有研究表明在大鼠模型中缺血再灌注所产生的损伤比缺血产生的影响更大[5]，因而ROS及其产生的氧化应激被认为是BOO引起膀胱功能障碍的主要原因。

2 膀胱出口梗阻中氧化应激生物标记物的变化

氧化应激引起的对组织的损伤会产生各种相应的产物分子，因而通过损伤后产物的检测能够作为氧化应激损伤的标志及其对组织损伤程度的评估。在BOO模型中，氧化应激的生物标志物的变化支持了氧化应激与膀胱功能障碍之间的关系。氧化应激所产生的生物标志物主要包括脂质过氧化的产物、蛋白质修饰的产物，如蛋白质羰基以及损伤DNA 产生的产物，如8-羟基-20 脱氧鸟苷(8-OHdG)、丙二醛(MDA)、异前列素(IsoPs)[6-7]。8-OHdG是自由基诱导的氧化损伤的主要形式，是广泛地应用在氧化应激、衰老、糖尿病和癌变的生物标志物，在人类和动物的研究中其升高可能是由于自由基对受损的细胞核或线粒体DNA的氧化攻击形成的[8]。在BOO 模型中，8-OHeG 主要出现于尿液中，在血液和组织中很难检测到或者很明显的检测到，尿中8-OHeG水平的变化支持了氧化应激与尿功能障碍之间的关联。MDA是一种在不饱和脂肪酸在氧化分解的过程中由酮醛分解产生的生理性酮醛，作为花生四烯酸盐代谢的副产物，其主要在血液中表现升高。MDA已经被用作评估氧化应激和组织破坏程度的标记物[9]，在BOO模型中显著升高[8]。IsoPs是自由基刺激脂质过氧化的最终产物[9]，f2-IsoPs 是一种在ROS的作用下产生的稳定的代谢产物，在组织中可被检测到，而在血液和尿液中检测不到[10]。

3 膀胱出口梗阻后的进展过程

膀胱出口长期的梗阻会使膀胱组织结构发生变化，功能减退，甚至最终导致肾脏功能障碍。膀胱出口梗阻使尿液潴留于膀胱中而不能按正常的排尿节律排出，从而引起膀胱体积增大，排尿压力增加，膀胱过度充盈，当压力大于出口的阻力时尿液得以排空，然而残尿量增加，再次充盈时尿液的潴留量进一步增加，压力也进一步增加，循环往复。周期性的膀胱过度充盈和排出引起膀胱缺血/再灌注损伤，长期的缺血/再灌注损伤及其产生的氧化应激引起膀胱功能变化、组织重构等一系列进展过程，甚至最终导致膀胱功能障碍。

膀胱出口梗阻的进展分为三个时期：肥大期、代偿期、失代偿期[11]。肥大期是由于膀胱长期反复的充盈，体积增大，压力增高，膀胱壁被反复拉伸，为了维持膀胱的正常功能，膀胱平滑肌增生肥大以克服排尿过程中阻力的增加，新生毛细血管大量增生以维持供氧需求的增加。随着平滑肌和毛细血管增生的停止，逐渐由肥大期进展到了代偿期，此期膀胱功能仍维持在正常范围内。然而随着平滑肌的大量增生，膀胱体积增大的范围有限，长期的缺血缺氧和慢性炎症最终激活一系列分子机制，引起膀胱平滑肌细胞萎缩和凋亡，导致细胞数量减少和神经元丢失，膀胱功能障碍。另外促进膀胱重构的分子机制也会被激活，其结果是成纤维细胞被活化，最终结果是大量的胶原和细胞外基质被大量合成并沉积于膀胱组织，导致膀胱扩张受限，收缩功能降低，最终引起肾脏功能的障碍[12]。

4 BOO病理生理过程与缺氧和氧化应激的相关性及分子机制

4.1 膀胱肥大期 膀胱肥大期平滑肌表现为增殖和体积增加，与平滑肌表型的转化相关，BOO 膀胱平滑肌“肌肥大”结构模式的特点有四个明显的特征，包括平滑肌细胞肥大、细胞与细胞之间的连接减少、细胞外机质沉积和血管的增生。过去的观点认为膀胱肥大及膀胱平滑肌(SMCs)的增生主要是由尿液对膀胱壁的机械压力引发一系列分子通路(如P38-MAPK 通路、PI3K-SGK1-Kv1.3 通路、JUN-AP-1通路等)的激活和细胞因子(如神经生长因子、表皮生长因子样生长因子)等及其他分子(如环氧化酶-2)的释放而导致的，近来的研究逐渐把主要原因归因于氧化应激和组织缺氧[13]。有研究表明氧化应激可引起多条通路引起多种生理病理功能，如ROS-P38-MAPK通路[14]、ROS-PI3K/AKt通路、RNS-TNF-α/NF-κB通路[15]。

4.1.1 一氧化氮合酶-ROS-PI3K-AKt通路 研究证实了一氧化氮合酶(nitric oxide synthase，NOS)在压力负荷的作用下引发氧化应激促进膀胱平滑肌肥厚和膀胱功能障碍的结果[16]。在BOO 的作用下一氧化氮合酶减少，同时也会使一氧化氮辅因子4 缺乏和转变为失活状态，这就使得NOS 合成NO 的能力降低，导致NO 最终转化为超氧阴离子(O2—)，称为NOS 解偶联[16]。压力超负荷会触发NOS的解偶联，促进活性氧的产生，最后导致膀胱平滑肌肥厚和膀胱结构的重塑[16]。近期的研究还阐述了部分其他导致膀胱肥大的分子机制，其主要是由缺氧和氧化应激引起膀胱平滑肌去分化，表现为α-平滑肌肌动蛋白、波形蛋白、结蛋白表达增加，并呈现为纤维化表型，其变化表现为胶原蛋白的增加。SMCs表型的转化可能与PI3K-AKt通路相关[17]。活性氧产生的氧化应激一方面引发炎症反应，另一方面ROS本身作为生物分子激活相关通路[1]，两者均可激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K)，活化的PI3K进一步活化其下游的丝氨酸/苏氨酸激酶(auto-ja kuljetusalan Ty ntekij liitto，Akt)分子，活化的AKt 促进平滑肌细胞内α-平滑肌肌动蛋白、H3、i型胶原蛋白等合成增加，诱导SMCs 去分化并表现出促进纤维化的表型，最终引起膀胱壁增厚、膀胱肥大[17-18]。有研究表明抑制体内PI3K通路可缓解因膀胱炎症导致的膀胱肥大及膀胱的储存功能[17]。

4.1.2 HIF 途径 缺氧状态下缺氧诱导因子-1(HIF-1)和血管内皮生长因子(VEGF)表达显著增加并呈时间依赖性，HIF-1α在梗阻后72 h达到顶峰，VEGF在2 h后增加两倍，并呈时间依赖性持续[19]。HIF-1和HIF-2 是密切相关的蛋白质复合物，分别由HIF-1α和HIF-2α组成，它们与组成型表达的HIF-1β亚单位形成异二聚体。在常氧条件下，HIF-1α亚单位迅速降解，而在低氧条件下，它被稳定和上调[19]。HIF激活多种基因的转录，这些基因编码参与广泛的生理过程以适应低氧条件的蛋白质，包括血管生成、细胞增殖、细胞周期控制，细胞死亡和能量代谢。增加的HIF-1 和VEGF促进膀胱组织新生血管的生成以抵抗缺氧状态，而大量增生的血管使得膀胱壁增厚[19-20]。HIF-1也被证实可以通过其他途径引起膀胱组织肥厚，研究表明使用HIF-1抑制物阿螺旋霉素(AlvespiMycin，17-DMAG)抑制HIF-1在膀胱出口梗阻(BOO)中引起膀胱肥大的作用，结果表明17-DMAG 可通过抑制HIF-1 而阻止膀胱体积和重量增加及膀胱肥大，并改善膀胱的功能，然而具体的分子通路需进一步探索[19]。

4.1.3 ROS-NF-κB-JMJD3 通路 先前的研究已证实了ROS可激活κ基因结合核诱导因子(nuclear factor-k-gene binding，NF-κB)通路，调节炎症的发生。有研究证明在脂多糖(LPS)诱导的膀胱炎模型中，磷酸化的NF-κB 的表达增加，据报道，赖氨酸特异性去甲基酶6B (KDM6B，又称JMJD3)作为NF-κB 的下游靶点，调节血管内皮细胞炎症基因的表达[21]。NF-κB通过激活JMJD3，而活化的JMJD3 通过上调周期蛋白D1(CCND1)，促进其过表达。GSK-J4 作为JMJD3 的抑制剂，能降低细胞的增殖指数。在研究中与LPS组相比，LPS+GSK-J4组CCND1的mRNA和蛋白水平均显著降低，提示JMJD3 通过调节CCND1 的表达影响细胞增殖[21]。活化的JMJD3 还可促进Ⅰ型/Ⅲ型胶原蛋白(COL1/3)表达的增加，进而引起胶原的沉积，在平滑肌细胞中胶原的沉积可引起平滑肌细胞的肥大。而使用NF-κB 抑制剂JSH 可显著抑制细胞增殖，JSH还可显著降低CCND1mRNA的表达，最终结果表明该通路可引起膀胱平滑肌增值肥大，膀胱壁增厚[21]。

4.1.4 其他分子途径 在多发性硬化症的研究中，氧化应激可通过激活P38-MAPK-SGK1通路引起疾病的发生和进展，而该通路在BOO中可被低压刺激激活引起平滑肌增殖，因而在BOO中氧化应激或许可引起血清/糖皮质激素调节激酶1(recombinant serum/glucocorticoid regulated kinase 1，SGK1)的活化成为平滑肌细胞增殖的潜在机制，有待进一步的研究证实[22-23]。缺氧和氧化应激在膀胱肥大和组织重构中的作用的相关研究还比较局限，但是已经有很多研究表明在BOO动物模型中逆转缺氧和抗氧化应激的治疗能够有效地抑制膀胱组织的肥大和功能障碍以及阻止BOO 后续的一系列发展，然而其致病机制还需进一步研究和发掘。

4.2 代偿期 早期缺血缺氧可促进旁观平滑肌增生和新生血管的生成，随着缺血缺氧的持续，梗阻的中后期出现严重的缺血再灌注损伤，平滑肌肥大/增生和新生血管的停滞，膀胱功能进入代偿期，该期排出功能基本维持正常。平滑肌减少和功能减退正常：平滑肌的功能与细胞内Ca2+的平衡相关，代偿期缺血再灌注产生大量活性氧，活性氧将脂质过氧化导致平滑肌膜损伤及破坏细胞器膜，导致Ca2+失调，Ca2+失调导致平滑肌功能障碍并能够激活相关蛋白酶和脂肪酶活性增加，进一步破坏膀胱功能。另外，ROS 还可通过激活线粒体途径引起细胞凋亡，主要机制是引起Bcl-2相关蛋白X/B细胞淋巴瘤/白血病-2(Bax/Bcl-2)比例升高和细胞色素C的释放。这些凋亡途径都增加了平滑肌细胞的凋亡，使膀胱功能障碍[24]。

4.3 失代偿期 如果梗阻的状态没有解除，膀胱周期性的收缩和舒张将会反复压迫血管，引起周期性的缺血和再灌注，膀胱重构将继续进行，最终导致膀胱功能转入失代偿阶段，其表现为膀胱顺应性降低和残余尿的增加[25]。

4.3.1 MMPS/TIMPS 途径 膀胱功能失代偿与纤维化导致膀胱顺应性密切相关，纤维化主要是与细胞外基质，如i、iii型胶原蛋白、纤黏蛋白等的沉积及弹性蛋白的减少相关。胶原和细胞外机制在细胞间的沉积主要受蛋白水解酶，即基质金属蛋白酶(MMPS)的调节，而蛋白水解酶的活性受其抑制物，即金属蛋白酶的组织抑制剂(TIMPS)的调节，因而蛋白水解酶与其抑制剂之间的平衡是胶原和外机制沉积与否的关键[26]。当细胞外基质沉积过多或蛋白水解酶与其抑制物之间平衡失调都会导致膀胱纤维化的发生。有研究显示在用H2O2处理后的视网膜细胞中TIMP-1在细胞内表达增加，并呈H2O2依赖性，是氧化损伤引起改变的目标之一。虽然在BOO中未涉及研究，但可表明在BOO 诱导的氧化应激可使TIMP-1增加，使金属蛋白酶及其抑制物之间的平衡失衡。还有研究显示活性氧可以直接激活TIMP-1，并可促进其转录，增加其活性，加剧纤维化[26-27]。

4.3.2 TGFβ-smad1/2 途径 转化生长因子-β(TGF-β)途径是引起细胞外基质沉积的最主要的通路[28]，该通路主要通过配体与受体的结合和激活产生作用，最终活化转录激活因子smad1/2，并激活启动子和辅助因子，促进基因的转录。成纤维细胞的增殖和分化受该通路的调节，并合成胶原和细胞外机制。有研究表明氧化应激可激活TGF-β，引起一系列后续的反应，导致膀胱纤维化，TGF-β也可增加活性氧的产生并可抑制抗氧化酶的活性，TGF-β与活性氧之间的相互作用加剧了膀胱的纤维化[29-30]。

4.3.3 NLRP3-IL-1途径 炎症体复合物3(nucleotide-binding oligomerization domain，leucine-rich repeat and pyrin domain-containing 3，NLRP3)是引起炎症和膀胱纤维化的关键物质[31]。NLRP3 的典型功能是炎症小体的核心组成部分，炎症小体是由NLRP3蛋白、凋亡相关斑点样蛋白[含有CARD结构域(ASC)衔接蛋白]和半胱氨酸蛋白酶Caspase-1 组成的复合物。NLRP3 炎症小体的组装将前胱天蛋白酶-1 切割成活性形式，其介导促炎细胞因子的成熟，包括白细胞介素(IL)-1β和IL-18。IL-1β是引起纤维化的关键因子[32]。缺血-再灌注和压力拉伸促进损伤相关的分子模式(damage associated molecular patterns，DAMPs)释放，NLRP3因此被激活并产生IL-1β，IL-1β然后与IL-1受体1 结合并促进前胶原释放和切割、修饰成为成熟的胶原并转运到固有层。IL-1β也可以通过激活TGF-β，其再活化smad1/2引起细胞外基质的沉积[32]。

4.3.4 其他途径 有研究表明缺血-再灌注损伤能产生单核细胞趋化蛋白(MCP-1)，该蛋白可结合巨噬细胞的特异性受体促进巨噬细胞趋化、激活和极化成不同的亚群，其中M2群与膀胱纤维化有关，通过阻止该途径可缓解膀胱的纤维化[33]。还有证据显示缺血缺氧引起炎症途径可诱导NF-kB 活化，活化的NF-kB进一步激活下游的JMJD 分子，进一步激活COL1 和COL3 引起胶原沉积[21]。JMJD 分子还可促进炎症介质如白介素-11(IL-11)和白介素8(IL-8)等显著上调，以及促进金属蛋白酶1(TIMP1)和TIMP2的组织抑制剂的表达显著上调，引起膀胱纤维化[21]。有研究表明一些RNA 分子也有抑制纤维化的作用，如MicroRNA101、MicroRNA-219c-5p等[30，34]。

4.3.5 神经元丢失 膀胱功能维持正常的一个重要的因素是正常的神经传导，机械压力刺激膀胱壁压力感受器并通过感觉神经传入相应的刺激到中枢，中枢发出运动神经支配膀胱平滑肌收缩引发排尿动作。缺血-再灌注引起的缺氧和氧化损伤会直接损害周围神经，也能减少神经营养因子的产生从而损害其对周围神经的营养支持作用，这都会导致膀胱中神经的退化，引起膀胱收缩功能的障碍。另外神经营养因子还是抗氧化机制的重要调节剂，可诱导抗氧化酶的表达，其减少又进一步加重氧化应激引起的损伤，形成恶性循环，加剧膀胱功能的恶化[35]。

5 总结

目前的研究已经为氧化应激作为膀胱出口梗阻(BOO)引起膀胱功能和结构障碍的重要原因提供了大量的证据，多条在BOO进展过程中发挥作用的分子通路都证明了氧化应激作为重要环节来诱导膀胱功能和结构的变化。然而在BOO中有许多与氧化应激相关的分子机制和病理过程仍不清楚，还需要进一步的研究来弥补这样的空缺和推动氧化应激在BOO的发生发展过程中发挥作用的研究进展以及为克服BOO在临床上遇到的难题提供研究证据和潜在的治疗策略。