响应面法优化抑菌洗液提取工艺的研究

彭一峰， 李文慧， 来海中， 孙琰琴,4， 徐建军， 张 薇， 罗恒磊， 冀祖恩,

(1新疆全安药业股份有限公司； 2新疆甘草及制品研究重点实验室， 新疆 库尔勒 841000； 3中国科学院新疆理化技术研究所， 乌鲁木齐 830011；4新疆凯美嘉生物科技有限公司， 新疆 昌吉 831100; 5新疆环拓生物科技有限公司， 乌鲁木齐 830011)

抑菌洗液是由苦参、百部、黄柏、蛇床子、醋酸氯己定、甘草总黄酮组成，具有清热解毒，燥湿止带的功效，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌病原微生物引起的妇科炎症有较好的抗菌消炎作用，临床多用于私处清洁和日常卫生护理[1-3]。中药材在治疗阴道炎症方面积累了丰富的经验，在菌群平衡方面具有明显优势[4-6]。本研究采用响应曲面法优化抑菌洗液的提取工艺，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 仪器与设备LMQC-80E型立式灭菌器(山东新华医疗器械股份有限公司)，SPX-150型生化培养箱(上海金慧科电子有限公司)；ZHJH-C1112B型超净工作台(上海智诚分析仪器制造有限公司)。

1.2 药材与试剂药材苦参、百部、黄柏、蛇床子均在2020年9月采购于新疆维草集药材有限公司，由新疆全安药业有限公司赵向英药师鉴定为豆科植物苦参(SophoraflavescensAit.)、百部科植物直立百部[Stemonasessilifolia(Miq.)]、芸香科植物黄皮树(PhellodendornChinense Schneid.)、伞朵科植物蛇床[Cnidiummonnieri(L.)Cuss.]。甘草总黄酮(新疆全安药业股份有限公司，批号：D2022001)。金黄色葡萄球菌(苏州大禧生物科技有限公司，批号：CMCCB26003)，大肠杆菌(苏州大禧生物科技有限公司，批号：CMCCB44102)，白色念珠菌(苏州大禧生物科技有限公司，批号：CMCCF98001)。

2 方法

2.1 单因素试验设计以抑菌洗液对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌圈直径大小来判断抑菌效果为指标，固定其他工艺条件，依次改变煎煮提取时间(1、2、3、4、5、6 h)、煎煮次数(1、2、3、4、5、6 次)、液料比(v∶m,6∶1、7∶1、8∶1、9∶1、10∶1、11∶1)进行测定。

2.2 抑菌实验测定采用梯度稀释比浊法，将白念珠菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌配成106 CFU/mL的菌悬液备用。取上述菌悬液0.2 mL分别涂布在相应的胰酪大豆胨琼脂培养基，取经灭菌直径为 5.5 mm的圆形滤纸片，每片滴加抑菌洗液5 μL，以生理盐水为对照组，在37℃的环境下，将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌培养基培养24 h；在28℃的环境下，将白色念珠菌培养基培养48 h。测量抑菌圈的直径，重复测定3次，取平均值。

2.3 响应面试验设计依据Box-Behnken实验设计原则，在前期单因素实验结果基础上，选取对抑菌洗液中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等抑菌圈直径大小影响较大的3个因素：液料比，煎煮次数和煎煮提取时间，各取3个水平分别记为水平-1、0、1，进行因素水平共17个试验点的响应曲面分析试验，并运用数据统计分析软件进行数据分析，进而得到最佳抑菌洗液中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果的条件，见表1。

表1 3因素3水平响应曲面分析实验设计表

3 结果

3.1 单因素实验结果

3.1.1 煎煮提取时间对抑菌洗液抑菌效果的影响 当煎煮提取时间为2 h时，抑菌洗液对大肠杆菌抑菌圈直径为8.30 mm，对金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为21.56 mm，对白色念珠菌抑菌圈直径为12.00 mm。因此确定煎煮提取时间为2 h，见表2。

表2 煎煮提取时间对抑菌效果的影响

3.1.2 煎煮次数对抑菌洗液抑菌效果的影响 当煎煮提取次数为2次时，抑菌洗液对大肠杆菌抑菌圈直径为9.89 mm，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为19.90 mm，白色念珠菌抑菌圈直径为10.90 mm。因此确定煎煮提取次数为2次，见表3。

表3 煎煮次数对抑菌效果的影响

3.1.3 液料比对抑菌洗液中抑菌效果的影响 液料比为8倍时，抑菌洗液对大肠杆菌抑菌圈直径为8.85 mm，金黄色葡萄球菌抑菌圈直径为22.40 mm，白色念珠菌抑菌圈直径为11.30 mm。因此确定液料比值为8倍，见表4。

表4 液料比对抑菌效果的影响

3.2 响应面设计及结果

3.2.1 响应面实验设计 在单因素试验结果基础上，选择影响较大的3个因素：煎煮提取时间和煎煮次数，液料比，各取3个水平分别记为水平-1、0、1，进行因素水平共17个试验点的响应曲面分析试验，采用抑菌实验测定大肠杆菌抑菌环直径、金黄色葡萄球菌抑菌环直径、白色念珠菌抑菌环直径大小来判断抑菌效果，直径越大抑菌效果越好，见表5。

表5 响应曲面优化抑菌洗液抑菌效果实验设计与结果

3.2.2 响应面实验数据 运用Design expert 10.0数据分析软件对试验数据进行多元回归拟合，设液料比、煎煮次数和煎煮提取时间分别为A、B、C，分别以抑菌洗液中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌抑菌效果为响应值进行多元回归拟合，得到二次多项回归模型如下：

3.2.4 各因素的交互作用 一次项液料比倍数、煎煮次数、煎煮提取时间对抑菌洗液中大肠杆菌抑菌效果均具有极显著影响(P<0.01)，大肠杆菌中各因素的主效应关系为：B>C>A，即煎煮次数>煎煮提取时间>液料比。金黄色葡萄球菌抑菌效果分析各因素的主效应关系为：C>B>A，即煎煮提取时间>煎煮次数>液料比。白色念珠菌抑菌效果分析各因素主效应关系为：C>A>B，即煎煮提取时间>液料比>煎煮次数，见图1-9。

表6 抑菌洗液中大肠杆菌抑菌效果模型及回归系数的回归分析结果

表7 抑菌洗液中金黄色葡萄球菌抑菌效果模型及回归系数的回归分析结果

表8 抑菌洗液中白色念球菌抑菌效果模型及回归系数的回归分析结果

3.3 验证试验结果根据回归方程模型结合响应面，得到预测的最优条件为：液料比为7.909倍、煎煮次数为2.574次、煎煮提取时间为2.593 h。根据实际操作，将实验条件修正为液料比为8倍、煎煮次数为2次、煎煮提取时间为2.5 h，证实了预测值和实验值之间的良好相关性，表明试验模型可靠。根据重复性实验且工艺稳定，因此适用于优化抑菌洗液的工艺提取。优化后的抑菌洗液提取工艺对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌的抑菌效果更好，见图10-12。

图2 液料比(A)、提取时间(C)交互作用对大肠杆菌抑菌效果的响应图和等高线

图3 提取次数(B)、提取时间(C)交互作用对大肠杆菌抑菌效果的响应图和等高线

图4 液料比(A)、煎煮次数(B)交互作用对金黄色葡萄球菌抑菌效果响应图和等高线

图5 液料比(A)、提取时间(C)交互作用对金黄色葡萄球菌抑菌效果的响应图和等高线

图6 提取次数(B)、提取时间(C)交互作用对金黄色葡萄球菌抑菌效果的响应图和等高线

图7 液料比(A)、煎煮次数(B)交互作用对白色念珠菌抑菌效果的响应图和等高线

图8 液料比(A)、提取时间(C)交互作用对白色念珠菌抑菌效果的响应图和等高线

图9 提取次数(B)、提取时间(C)交互作用对金黄色葡萄球菌抑菌效果的响应图和等高线

注：1，2，3为响应面设计中实验组，4为优化工艺实验组。

注：1，2，3为响应面设计中实验组，4为优化工艺实验组。

注：1，2，3为响应面设计中实验组，4为优化工艺实验组。

4 讨论

超声提取[7-9]、微波提取[10]、超临界流体提取等[11]新型药材提取方法，设备相对昂贵，提取成本较高。结合抑菌洗液中苦参、百部、黄柏、蛇床子等中药材理化性质及生产成本方虑，采煎煮法进行工艺提取，具有成本较低、操作简单、无溶剂残留等优点[12-15]，提取物对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、白色念珠菌等病原微生物有较强抑制作用。本研究采用响应面法优化抑菌洗液提取工艺，工艺稳定，简单可行，为抑菌洗液的工艺提取发展提供了理论依据。