EZRIN与ASAP3在食管鳞癌中的表达及临床病理学意义

管雅玲， 季 敏， 肖锦玲， 刘 丽， 苏丽萍， 马丽娟， 蒲红伟

(新疆医科大学1基础医学院， 2第一附属医院病理科， 3第一附属医院学科建设科， 乌鲁木齐 830011)

食管癌是人类最常见的消化道恶性肿瘤之一，它是癌症相关死亡的第六大常见原因，也是全球第七大最常见的癌症[1]。食管癌在组织学上可分为食管腺癌和食管鳞癌，其中食管鳞癌约占我国食道肿瘤病例的90%以上[2]。食管鳞癌患者通常由于诊断时期较晚而预后较差[3]，因此早期精准诊断对提高食管鳞癌患者整体生存率具有重要意义[4]。

EZRIN是ERM蛋白家族的重要成员，对蛋白结构稳定性和完整性的维持发挥着重要作用[5]。研究表明，EZRIN在不同癌症的侵袭和转移中充当肿瘤转移调节剂[6]。此外，它还介导许多细胞活动，如极性、运动性、黏附和生长等，这些与癌症的发展和进展有关。ASAP3是一种 Arf GTPase 激活蛋白，也称为 DDEFL1和ACAP4，具有SH3结构域、锚蛋白重复序列和PH结构域3，在运输细胞内囊泡、组装细胞骨架、促进细胞生长和迁移等方面发挥重要作用[7]。Fang等[8]证明EZRIN可通过ASAP3的N端400个氨基酸以蛋白激酶A介导的磷酸化依赖性方式与ASAP3相互作用。有学者阐明Hp相关慢性胃炎癌变的分子机制，与EZRIN-ASAP3信号通路中细胞可塑性的调控及其非可控性炎症介导的肿瘤迁移有关，同时还筛选出ASAP3的小分子抑制剂BUCM1并证实了其治疗作用，进一步验证EZRIN-ASAP3信号通路在肿瘤的发生、发展中具有重要作用[9]。已有学者证实EZRIN在食管鳞癌中高表达[10]，但目前对于EZRIN与ASAP3在食管鳞癌中表达状态如何，是否具有临床意义方面的研究尚少。本研究旨在分析食管鳞癌中EZRIN、ASAP3的表达水平及其与临床病理参数间的关系，以及与预后的相关性。

1 资料与方法

1.1 一般资料食管鳞癌组织芯片样本175例及食管鳞癌癌旁组织芯片样本60例由新疆医科大学第一附属医院样本库提供，收集2008年1月—2018年12月经手术切除的食管鳞癌组织，其中男性123例，女性52例。纳入标准：首次病理诊断为食管鳞癌，既往未接收过放疗、化疗等任何治疗，且具有完整的临床病理资料者。排除标准：存在中枢神经系统恶性淋巴瘤或其他影响生存期的恶性疾病患者；精神类疾病患者；临床资料不完整或术前经过治疗者，制片不佳无法判断免疫组织化学结果的。该项目获得新疆医科大学医学伦理委员会批准，伦理审批号：K201909-03，所有患者均已签署标本使用知情同意书。

1.2 主要试剂小鼠单克隆EZRIN抗体(购于英国Abcam公司，货号：ab4069)；兔多克隆ASAP3抗体(购于中国Bioss公司，货号：bs-5832R)；PBS、EDTA抗原修复液、山羊血清、过氧化氢、通用型二抗(均购于中国中杉金桥)。

1.3 免疫组织化学方法将芯片组织进行脱蜡、水化，H2O2阻断内源性过氧化物酶，使用EDTA溶液进行抗原修复，加入小鼠单克隆EZRIN抗体(1∶500)、兔多克隆ASAP3抗体(1∶150)，阴性对照用0.01 mol/L磷酸盐缓冲液，阳性对照用食管鳞癌阳性组织芯片，37℃孵育时间60 min；加通用型二抗，PBS洗净，DAB显色，苏木素复染，脱水，封片。结果的分析及判定：由两名主治及以上高级病理学医师使用双盲法对切片进行评估，根据其染色强度，将切片分为未染色(无色)、弱染色(浅黄色)、中度染色(浅棕色)和强染色(深棕色)，分别得分为0、1、2和3。阳性细胞的标准如下：0(0%)、1(1%～30%)、2(31%～60%)和3(61%～90%)。根据染色指数(SI =染色强度×阳性细胞的百分比)，染色结果记录为阴性(0～3分)或阳性(4～9分)，其中4～5分被认为低水平表达，6～7分中等表达，8～9分高水平表达[11]。根据上述标准，EZRIN与ASAP3表达分为强阳性、中度阳性、弱阳性和阴性。

1.4 生存分析主要通过电话、门诊检查和住院随访等三种方式来实时动态收集患者近期临床和生存健康质量信息，以患者的死亡发生时间为终点事件，随访记录信息至2019年12月31日。失访患者自失去联系当月起按截尾数据计算。

1.5 统计学分析所有样本数据均采用SPSS 26.0软件进行统计分析，计数资料采用χ2检验和Fisher精确概率法检验，分析EZRIN与ASAP3的表达与临床病理参数的相关性；采用Spearman相关分析法进行关联性分析；绘制Kaplan-Meier曲线以评估EZRIN与ASAP3在食管鳞癌患者中的预后值；采用Cox回归试验分析影响食管鳞癌预后的潜在因素，以P<0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 食管鳞癌患者EZRIN表达与临床病理特征的关系免疫组化结果显示，EZRIN在癌旁组织呈阴性表达，EZRIN在食管鳞癌的细胞质中呈高表达，见图1a-d；HE染色结果见图1e-f。EZRIN在食管鳞癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为82.3%和20.0%，差异具有统计学意义(χ2=77.675，P=0.000)。EZRIN与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移具有相关性；与性别、年龄、肿瘤大小、血管浸润、神经侵犯无相关性，见表1。

表1 EZRIN在食管鳞癌中的表达及临床相关病理参数分析

2.2 食管鳞癌患者ASAP3表达与临床病理特征的关系ASAP3在癌旁组织中呈阴性表达，在胞浆中呈高表达，见图2a-d；HE染色结果见图2e-f。ASAP3在食管鳞癌组织和癌旁组织中的阳性表达率分别为70.9%和30.0%，差异有统计学意义(χ2=31.190，P=0.000)。ASAP3与性别、肿瘤大小、分化程度、浸润深度、TNM分期及淋巴结转移具有相关性；与年龄、血管浸润、神经侵犯无相关性，见表2。

a：免疫组化图，EZRIN在癌旁组织呈阴性表达；b-d：免疫组化图，EZRIN在食管鳞癌的细胞质中呈高表达；e：HE染色图，EZRIN癌旁组织；f：HE染色图，EZRIN食管鳞癌组织。

a：免疫组化图，ASAP3在癌旁组织呈阴性表达；b-d:免疫组化图，ASAP3在食管鳞癌的细胞质中呈高表达；e：HE染色图，ASAP3癌旁组织；f：HE染色图，ASAP3食管鳞癌组织。

表2 ASAP3在食管鳞癌中的表达及临床相关病理参数分析

2.3 EZRIN与ASAP3在食管鳞癌发展中的相关性分析EZRIN和ASAP3共同阳性表达108例(75.0%)，EZRIN阳性表达ASAP3阴性表达36例(25.0%)，EZRIN和ASAP3共同阴性表达15例(48.4%)，EZRIN阴性表达ASAP3阳性表达16例(51.6%)。EZRIN与ASAP3表达呈正相关(r=0.196，P=0.009)。

2.4 EZRIN与ASAP3在食管鳞癌中的表达水平与预后的相互关系生存期类型分为5年生存、总生存、无进展生存、无病生存，本文应用总生存期(OS)对食管鳞癌患者预后进行分析，结果显示，EZRIN高表达患者中位总生存时间(OS)为40个月，低表达患者OS为38个月，两者间未发现显著相关性(P=0.919)，见图3a；与ASAP3低表达患者相比，ASAP3高表达患者的总生存时间更短(P<0.05)，见图3b；同时，当肿瘤直径>3 cm时，ASAP3高表达患者的OS时间比低表达患者短，存在显著相关性(P=0.000)，见图3c；在病理分期TNM III期，ASAP3高表达患者的OS时间比ASAP3低表达患者短(P=0.000)，见图3d；当肿瘤浸润全层以及患者发生淋巴结转移且ASAP3高表达时，OS值较短(P= 0.004，P= 0.000)，见图3e、f。表明ASAP3的表达水平与食管鳞癌患者的预后密切相关。

2.5 影响食管鳞癌患者预后的因素Cox单因素分析结果显示，性别、TNM分期、淋巴结转移、血管浸润、ASAP3表达情况对食管鳞癌患者预后有影响(P<0.05)，见表3。以食管鳞癌患者的生存时间和生存状态为因变量，将单因素分析中有统计学意义的5个病理参数(性别、TNM分期、淋巴结转移、血管浸润、ASAP3表达情况)作为协变量，纳入多因素Cox比例风险回归模型。TNM分期设为哑变量，变量赋值见表4，结果显示TNM IIIA+B+C、ASAP3高表达是影响食管鳞癌预后不良的独立危险因素(HR=2.090，P<0.01；HR=0.149，P<0.01)，见表5。

表3 食管鳞癌患者生存预后的Cox单因素分析/例

图3 EZRIN、ASAP3在食管鳞癌中表达水平的Kaplan-Meier生存曲线

表4 变量赋值表

表5 食管鳞癌患者生存预后的Cox多因素分析

3 讨论

食管鳞癌是具有高侵袭性的恶性肿瘤之一，且发病率呈逐年升高趋势。目前，食管鳞癌的治疗方式主要包括手术，化疗和放疗。然而，多数食管癌患者确诊时已处于中晚期，尽管手术及放、化疗在一定程度上延长了患者的生存时间，但术后5年生存率仍不足30%。因此，需要进一步研究食管鳞癌的发病机制，以优化诊断和治疗方案。

EZRIN蛋白由位于染色体6q 25.2-q26的EZR基因编码，含有FERM结构域(band 4.1 protein, Ezrin, Radixin, Moesin)，中央螺旋连接区域和ERM 相关结构域，是ERM蛋白家族中研究最多的成员，可以促进细胞生长、细胞极性、运动性、黏附功能，对维持细胞蛋白结构和功能具有重要作用，亦是促进癌症发生和进展的基因[12]。在肿瘤发展过程中，EZRIN蛋白的相对膜定位增加，细胞之间接触被破坏。因此，EZRIN蛋白的活化促进了肿瘤进展和侵袭的过程。Chetry等[13]研究发现EZRIN在宫颈癌中上调且与晚期转移和不良预后有关。Kolegova等[14]学者研究发现EZRIN主要分布在肺癌组织和转移灶中,EZRIN表达与肺癌患者的淋巴转移程度，恶性表型和晚期TNM分期显著相关，下调EZRIN蛋白可以逆转肺癌的恶性生物学行为。有研究发现EZRIN通过Akt信号转导促进乳腺癌进展和转移，并且增加乳腺癌患者复发的风险[15]。目前已有研究表明EZRIN在多种肿瘤中发挥作用，其中在食管鳞癌细胞发挥促癌作用，Li等[16]团队研究分析了98名健康人群和149名食管鳞癌患者的血清中EZRIN的抗体表达水平，研究结果显示，血清样本中EZRIN的自身抗体水平在食管鳞癌患者中呈高表达，但其患者血清中EZRIN抗体阳性表达率与年龄、性别、肿瘤大小、肿瘤浸润深度、肿瘤部位、组织学分级、淋巴结状态无显著差异。本次实验结果显示EZRIN 阳性表达率为82.3%(144/175)，说明 EZRIN的表达可能与食管鳞癌的发生、发展有关。同时本研究结果显示，EZRIN与分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移有关,其中低分化、全层浸润、TNM IIIA+B+C期及有淋巴结转移阳性率更高，提示EZRIN的表达在食管鳞癌分化程度、浸润深度、TNM分期、淋巴结转移方面存在差异，这与Li等[16]团队的研究结论不一致，考虑可能与样本量取材部位差异以及样本个体差异、样本量等混杂因素导致的数据及结果偏倚所致。

ASAP3是PCAF的同源底物，在Lys311中被乙酰化，这种CCL18(CC趋化因子配体18)引发的乙酰化通过调节ARF6活性在膜-细胞骨架动力学和细胞迁移中起关键作用[17]。Ha等[18]研究发现ASAP3被鉴定为Arf GAP，可以调节与癌细胞侵袭正常组织相关的细胞迁移。ASAP3可促进肿瘤的转移，且ASAP3表达高的患者预后较差。Mao等[19]通过免疫组织化学研究了ASAP3在乳腺癌中的表达，并与正常乳腺组织配对，发现ASAP3表达与肿瘤大小、淋巴结转移、TNM分期显著相关，与绝经期或年龄无关。田海英[20]研究发现ASAP3蛋白在某些大肠癌组织结构中的极高选择性表达促进导致了消化道肿瘤干细胞的迅速增殖、侵袭扩散和转移，从而间接影响大肠癌晚期患者未来的预后。本研究结果发现ASAP3在食管鳞癌组织的阳性表达率显著高于癌旁组织，并且与患者的临床病理参数及预后相关，差异具有统计学意义(P<0.05)。ASAP3可与EZRIN相互作用，孟涵等[21]研究发现EZRIN蛋白表达水平在慢性胃炎脾胃虚寒证、脾胃湿热证患者的病理进展中无显著差异，ASAP3蛋白在异型增生阶段表达水平较高，ASAP3-EZRIN信号通路在慢性胃炎恶性转化过程中发挥着一定作用。同时本研究结果显示EZRIN与ASAP3表达呈正相关(r=0.196，P=0.009)，EZRIN与生存期之间的差异无统计学意义(P>0.05)，考虑可能与样本量偏少以及样本个体差异导致的数据及结果偏倚所致。与ASAP3低表达患者相比，ASAP3高表达患者的总生存时间更短(P<0.05)，ASAP3高表达和TNM IIIA+B+C是影响食管鳞癌预后不良的独立危险因素。因此推断EZRIN和ASAP3可能在食管鳞癌中共同作用，促进食管鳞癌的发生发展过程，并且可能通过EZRIN-ASAP3信号通路调控食管鳞癌的发生发展。

综上所述，本研究证实了EZRIN和ASAP3在食管鳞癌中显著高表达，并且呈正相关。但本次研究局限于免疫组化实验结果，不能充分准确地全面解释EZRIN和ASAP3在食管鳞癌发生发展中的具体作用机制，这也是本课题后续研究的主要内容，为食管鳞癌临床治疗和诊断工作提供新的靶点和思路。