高分辨质谱法和核磁共振法定性分析合成阿片类新精神活性物质2-甲基-布桂嗪

何思阳,王跨陡,邓乾亚,汪 蓉,梁 晨,龚飞君

(上海市公安局物证鉴定中心,上海市现场物证重点实验室,上海 200083)

为提升吗啡、可待因等天然阿片类药物治疗急慢性疼痛的效果,并降低依赖等副作用,在过去半个多世纪,制药工业开发了多种合成阿片受体激动剂,其中仅有少部分通过了严格的药物试验后出现在药品市场,更多的则是由于各种原因被放弃,仅存在于相关科学文献中。伴随新精神活性物质的不断发展,这些被放弃的药物成为不法制造商的目标,逐渐被挖掘后出现在毒品市场[1-4]。联合国毒品和犯罪问题办公室相关报告显示,在已知的950种新精神活性物质中,约有8%为合成阿片类[5]。2012-2014年,3,4-二氯-N-[(1-二甲氨基环己基)甲基]苯甲酰胺(AH-7921)和1-环己基-4-(1,2-二苯基乙基)哌嗪(MT-45)成为最早一批在互联网出现的合成阿片类药物;2014 年后N-(2-氨基环脂)苯甲酰胺衍生物(U 系列化合物)开始被逐渐查获,其中N-甲基-N-(2-二甲氨基环己基)-3,4-二氯苯甲酰胺(U-47700)至今依然是最常见的非芬太尼类合成阿片类药物之一[6-9]。中国在2015年将AH-7921列入管制,在2017年将MT-45和U-47700列入管制;2019年,在先前已经列管的25种芬太尼类化合物和两种芬太尼前驱体基础上,进一步将整类芬太尼类物质列入管制。严格的立法减缓了新型芬太尼类物质的出现速率,然而新型非芬太尼类合成阿片类药物的出现依然给人民生命健康带来巨大危害[10-12]。

本工作采用气相色谱-四极杆飞行时间质谱法(GC-Q-TOF MS)、高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱法(HPLC-LTQ/Orbitrap MS)两种高分辨质谱法对案件中缴获的可疑白色粉末进行分析,通过核磁共振法(NMR)对其进行鉴定。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

7890B-7250型气相色谱-四极杆飞行时间质谱联用仪;LTQ-Orbitrap XL型高效液相色谱-线性离子阱/静电场轨道阱质谱联用仪;JNM-ECZR 600型核磁共振仪。

所有试剂均为色谱纯;试验用水为超纯水。

1.2 仪器工作条件

1.2.1 GC-Q-TOF MS

1)色谱条件 HP-5MS UI石英毛细管色谱柱(30 m×0.25 mm,0.25μm);载气为氦气(纯度不小于99.999%),流量1.085 mL·min-1;进样口温度260 ℃;进样量1μL;分流进样,分流比20∶1;溶剂延迟时间3.5 min。柱升温程序:初始温度60℃,保持1.0 min;以40 ℃·min-1速率升温至120 ℃;再以5 ℃·min-1速率升温至280 ℃,保持10.5 min。

2)质谱条件 电子轰击离子(EI)源;电离能量70 eV;离子源温度280℃,四极杆温度150℃;全扫描模式,扫描范围 质荷比(m/z)45～500。进样前,用全氟三丁胺溶液校正质谱质量轴,使m/z偏差小于5×10-6。采用Mass Hunter Qualitative Analysis B.07.00软件处理数据。

1.2.2 HPLC-LTQ/Orbitrap MS

1)色谱条件 Hypersil Gold C18色谱柱(50 mm×2.1 mm,1.9μm);柱温35 ℃;流动相A为0.1%(体积分数)甲酸溶液,B 为乙腈;流量250μL·min-1;进样量10μL。梯度洗脱程序:0～18 min时,A 由95%降至30%;18～20 min时,A由30%降至0;20～23 min时,A 由0升至95%。

2)质谱条件 电喷雾离子源正离子(ESI＋)模式电离;质量分析器FT Orbitrap;鞘气压力2.413×105Pa;辅助气流量160 L·h-1;喷雾电压4.0 kV,管状透镜电压120 V;毛细管温度275 ℃;扫描范围m/z50～1 000;二级质谱采用碰撞诱导解离(CID)模式,归一化碰撞能量35%。采用Xcalibur 2.0软件处理数据。

1.3 试验方法

将样品研磨均匀,用甲醇配制成0.1 g·L-1待测溶液,涡旋振荡1 min,以转速13 500 r·min-1离心3 min,取上清液供GC-Q-TOF MS检测。用甲醇稀释上清液,配制成1 mg·L-1待测溶液,供HPLC-LTQ/Orbitrap MS检测。取研磨后的样品约20 mg,用氘代甲醇溶解,配制成20 g·L-1待测溶液进行NMR 分析[磁场强度14.096 37 T(600 MHz)],采用JEOL Delta v5.0和Mest ReNova 12.0软件采集、处理数据。

2 结果与讨论

2.1 GC-Q-TOF MS结果

未知样品的总离子流色谱图及质谱图见图1。

图1 未知样品的色谱图和质谱图Fig.1 Chromatogram and MS spectrum of the unknown sample

由图1可知:未知样品保留时间为27.92 min,此外未有其他明显色谱峰出现;未知样品在EI源中主要特征离子峰有m/z286.203 7,215.154 0,195.149 0,172.111 8(次基峰),117.069 6(基峰)等,经NIST17等常用数据库检索未得到合适匹配。

观察未知样品的质谱图,发现其与国家管制麻醉药品布桂嗪(图2)有明显相似之处:两者基峰和次基峰一致;部分特征离子峰m/z286.203 7,215.154 0,195.149 0 与布桂 嗪m/z272.188 1,201.138 4,181.133 3相差约14,推测该物质可能为布桂嗪的甲基衍生物。未知样品中存在基峰m/z117.069 6,推测甲基不在肉桂基上;未知样品中不存在m/z201.138 4,而存在m/z215.154 0,推测甲基应在哌嗪环的某个碳原子上。

图2 布桂嗪质谱图Fig.2 MS spectrum of bucinnazine

2.2 HPLC-LTQ/Orbitrap MS结果

布桂嗪的一级、二级质谱图见图3。

由图3 可知:质子化分子离子峰[M＋H]＋为m/z273.196 5,二级质谱碎片为m/z117.070 0和m/z155.118 3,说明CID 模式下哌嗪环和肉桂基之间发生断裂。未知样品的一级、二级质谱图见图4。

图3 布桂嗪的一级、二级质谱图Fig.3 MS and MS/MS spectra of bucinnazine

由图4可见:未知样品[M ＋H]＋为m/z287.212 1,和布桂 嗪[M＋H]＋相差14.015 6,与CH2质量数14.015 1 接近,两者同位素峰比例相似;二级质谱中,未知样品m/z117.069 8和布桂嗪m/z117.070 0接近,m/z169.133 6 和m/z155.118 3相差14.015 3。综合两种高分辨质谱结果,推测未知样品分子式为C18H26N2O,比布桂嗪多出的CH2在哌嗪环上,其位置需用NMR 确定。

图4 未知样品的一级、二级质谱图Fig.4 MS and MS/MS spectra of the unknown sample

2.3 核磁共振结果

未知样品的碳原子编号如图5所示。试验通过核磁共振氢谱(1H-NMR)、核磁共振碳谱(13CNMR)、无畸变极化转移增强谱(DEPT)、异核多量子相关(HMQC)和异核多键相关(HMBC)确定18个碳位置,HMQC、HMBC、DEPT(135°)谱图见图6,1H-NMR、13C-NMR 数据见表1。

图6 未知样品的NMR 谱图Fig.6 NMR spectra of the unknown sample

表1 未知样品的1 H-NMR、13 C-NMR 数据Tab.1 1 H-NMR,13 C-NMR data of the unknown sample

表1 (续)

图5 未知样品的碳原子编号Fig.5 Carbon atom number of the unknown sample

1H-NMR 中化学位移δH(×10-6,以下δH、δC等均同)6.931～6.957和6.387～6.438内两个氢信号归属于烯键上两个氢,由裂分特点确定分属于7号碳和8号碳上的氢。根据HMQC和13C-NMR,7号碳和8 号碳分别归属于δC142.524,116.942。由化学结构可知,HMBC 谱图中,9 号碳与7 号和8号碳上的氢相关,9号碳上的氢与7号和8号碳相关,从而可确定9 号碳的δC为60.735,δH为3.948～4.017。

HMBC谱图中,与δH3.948～4.017 相关的碳信号有4 个,分 别为δC142.524(7 号碳),116.942(8号碳),52.399,56.072。由化学结构可 知,δC52.399,56.072为10号和12号碳,具体归属暂时未知。DEPT(135°)谱图中,δC52.399,56.072两个碳信号相位均为负,则10号和12号碳均为亚甲基,甲基位于13号碳(或11号碳)上。

HMBC谱图中,18号碳上的氢信号δH1.353～1.366和δH1.478～1.490与δC56.072碳信号相关,与δC52.399碳信号不相关。根据化学结构,18号碳上的氢与12号碳远程相关,与10号碳不相关,因此可归属10 号和12 号碳分别为δC52.399 和δC56.072。

2.4 布桂嗪和2-甲基-布桂嗪的碎裂途径推测

布桂嗪和2-甲基-布桂嗪的化学结构及其在GC-Q-TOF MS 中的主要特征离子信息见图7 和表2,由此推测两种物质在EI源中的碎裂途径见图8。

图7 布桂嗪和2-甲基-布桂嗪的化学结构Fig.7 Chemical structures of bucinnazine and 2-methyl-bucinnazine

图8 布桂嗪和2-甲基-布桂嗪的碎裂途径Fig.8 Fragmentation pathways of bucinnazine and 2-methyl-bucinnazine

表2 GC-Q-TOF MS中布桂嗪和2-甲基-布桂嗪的主要特征离子信息Tab.2 Main characteristic ion information of bucinnazine and 2-methyl-bucinnazine obtained by GC-Q-TOF MS

由图8可见:碎片A 在EI模式下,哌嗪环中的两个C-N 键容易断裂,分别形成碎片B、F和G;碎片B中的哌嗪环进一步发生重排,丢失CH2＝NH和CH2＝CHNH2,形成碎片D 和E;另一方面,肉桂基中的C＝C双键也容易断裂,形成碎片C。

本工作利用GC-Q-TOF/MS得到未知样品高分辨EI质谱数据,对比已列管的布桂嗪质谱信息,推测未知样品为布桂嗪的甲基衍生物,结合HPLCLTQ/Orbitrap MS数据进一步确认未知样品分子式为C18H26N2O,最终通过NMR 确定该未知样品为2-甲基-布桂嗪。

布桂嗪(CAS 号17719-89-0)的化学名为1-正丁酰基-4-肉桂基哌嗪,是20世纪60年代报道的可用于止痛的最有效酰基哌嗪类化合物之一[13-14],是μ阿片受体的强效和选择性激动剂,于1971年在中国仿制成功。文献[15]等研究结果表明布桂嗪存在明确的身体依赖性潜力,该物质已被列入《麻醉药品品种目录(2013年版)》。药理研究表明,在与布桂嗪结构相似的N-取代哌嗪类化合物中,同时存在N取代的丙酰基和芳烯基能提供最佳的μ阿片受体亲和力;动物试验表明,2-甲基-布桂嗪与μ 阿片受体的亲和力比布桂嗪的更强[16],说明2-甲基-布桂嗪可能具备更强的身体依赖性潜力,存在滥用风险。在全球对芬太尼类物质进行严格监管后,非芬太尼类新型合成阿片类药物被逐渐检测出来[17-19]。本工作提供了合成阿片类新精神活性物质2-甲基-布桂嗪全面的高分辨质谱和核磁数据,可为执法或进一步研究工作提供依据。