基于数码成像法的分子印迹纸芯片测定槐花中芦丁的含量

乐 薇,崔 昂,段凤琪,刘诗诗,胡 玥

(武汉工商学院 环境与生物工程学院,武汉 430065)

芦丁又称为芸香苷,是一种黄酮类化合物,广泛存在于植物中,具有抗炎症、抗病毒、抗辐射、抗自由基、保持及恢复毛细血管正常弹性等功效,是很多中草药的有效成分之一[1]。目前,芦丁含量的测定方法有化学发光法[2]、高效液相色谱法[3]、毛细管电泳法[4]和电化学法[5]等,这些方法具有灵敏度高和选择性好的优点,但大多存在成本高,检测过程复杂,对操作人员有一定专业技能要求等缺点,不适合现场快速测定。

微流控纸基分析芯片(简称纸芯片)是以纸或和纸相似的薄层纤维材料作为芯片基质,通过喷蜡打印、丝网印刷等技术在纸基上建立试剂流动及检测区域,具有成本低、易于操作、携带方便、检测迅速等优点,是快速测定装置的发展趋势[6-8]。分子印迹技术是指为获得在空间结构和结合位点上与某一分子(模板分子)完全匹配的聚合物的试验制备技术[9]。该技术以目标分子为模板,通过氢键等作用,使其与功能单体形成复合物[5],在交联剂的作用下引发聚合,在交联聚合物网络中,产生预定的特异性识别位点,这些位点在形态、尺寸上与目标分子相匹配,具有较好的选择性和特异性[10-12]。槐花是芦丁的主要来源,通常以芦丁含量作为槐花质量控制的标准[13]。鉴于此,本工作基于数码成像法,结合分子印迹技术和纸芯片,制备出对芦丁有高选择性的分子印迹纸芯片,为槐花中芦丁的快速检测分析提供方法参考。

1 试验部分

1.1 仪器与试剂

KQ-50E型超声波清洗器;JYO2S型紫外分析仪;9 SE型智能手机;HP LaserJet 1020plus型激光打印机。

芦丁标准储备溶液:0.200 0 g·L-1,称取10 mg芦丁标准品,用沸水溶解、冷却后定容至50 mL,配制成质量浓度为0.200 0 g·L-1的芦丁标准储备溶液。

芦丁标准溶液系列:移取0,0.5,1.0,1.5,2.0,2.5,3.0,4.0,5.0 mL 芦丁标准储备溶液,用水稀释至10 mL,配制成质量浓度分别为0,0.010 0,0.020 0,0.030 0,0.040 0,0.050 0,0.060 0,0.080 0,0.100 0 g·L-1的芦丁标准溶液系列。

芦丁标准品的纯度不小于98%;偶氮二异丁腈、丙烯酰胺、乙二醇二甲基丙烯酸酯、乙醇、甲醇、乙酸、氯化铝、氢氧化钠、氨水均为分析纯;试验用水为蒸馏水。

1.2 试验方法

1.2.1 芦丁分子印迹纸芯片的制备

由绘图软件Auto CAD 设计直径为6 mm 的圆形阵列式微流控图案,用激光打印机将其打印在A4大小的滤纸上,置于170 ℃烘箱中加热固化1.5 h[14],墨粉中的无色聚合物可形成疏水墙,从而获得白色的亲水区和黑色的疏水区,如图1所示。

图1 亲水、疏水区的制备Fig.1 Preparation of the hydrophilic and hydrophobic areas

称取0.030 2 g(0.05 mmol)芦丁标准品,加入5 mL 20%(体积分数)甲醇溶液,超声溶解10 min;然后加入0.106 6 g(1.5 mmol)丙烯酰胺,超声30 min;再加入0.991 1 g(5 mmol)乙二醇二甲基丙烯酸酯和0.01 g偶氮二异丁腈,超声聚合45 min,充分混匀后得到预聚液[15]。在亲水区中滴加14μL预聚液,置于60 ℃烘箱中干燥2 min,取出,接着将其浸泡于水中,振荡3 min,再浸泡于0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液中,洗去模板分子,直至洗脱液在365 nm 处无紫外吸收。最后用水将滤纸洗至中性,干燥备用,得到芦丁分子印迹纸芯片,圆形亲水区即为芦丁的检测区。按照相同的方法,不加芦丁标准品,制备非分子印迹纸芯片。

1.2.2 槐花中芦丁含量的测定

称取2.00 g槐花,压碎,加入10 mL 4 g·L-1沸腾的硼砂溶液,在搅拌下以饱和氢氧化钙溶液调节pH 至8～9,加热微沸30 min,过滤,重复提取一次,合并滤液,加水定容至25 mL。分取1.0 mL,加水定容至100 mL,得到芦丁待测液。在芦丁分子印迹纸芯片检测区中滴加5μL芦丁待测液(或芦丁标准溶液系列)和5μL 10%(质量分数)氯化铝溶液,室温下反应40 min。然后将纸芯片水平放置于紫外分析仪的暗箱中,于365 nm 波长下用手机进行拍照,获得荧光图片,每次拍摄均采用2倍焦距拍照模式。用Adobe Photoshop软件对图片进行处理,读取检测区R(红)、G(绿)、B(蓝)值,以R、G、B 值之和计算芦丁的质量浓度,并按照公式(1)计算槐花中芦丁的质量分数(w)。

式中:ρ为芦丁的质量浓度,g·L-1;V为芦丁待测液的体积,0.1 L;n为稀释倍数,100;m为槐花的质量,2.00 g。

2 结果与讨论

2.1 方法可行性研究

分别在芦丁分子印迹纸芯片和非分子印迹纸芯片的检测区依次滴加5μL 0,0.100 0,0.200 0 g·L-1芦丁标准溶液。结果表明:纸芯片上显色斑点的荧光颜色为绿色,并且随着芦丁质量浓度的增加,颜色逐渐变亮;而非分子印迹纸芯片上显色斑点的荧光颜色为暗蓝色,且几乎无变化。据此,可提出分子印迹纸芯片检测芦丁含量的方法。推测其检测原理为芦丁能被纸芯片上的印迹孔穴特异性吸附,吸附的芦丁与氧化铝反应,生成荧光显色物质。

2.2 芦丁分子印迹纸芯片制备条件的优化

2.2.1 预聚液滴加量

分别在检测区滴加5,8,10,14,16,18μL 预聚液,于60 ℃烘干2 min。结果发现:预聚液滴加量太多时会导致印迹膜太厚,易脱落;预聚液滴加量太少时则无法完全覆盖检测区;预聚液滴加量为14μL时刚好完全覆盖检测区且不溢出。因此,试验选择的预聚液滴加量为14μL。

2.2.2 超声聚合时间

试验考察了超声聚合时间分别为10,15,20,25,30,35,40,45,60,90 min时芦丁显色斑点R、G、B值的变化情况,平行测定3次,分别计算R、G、B值的平均值和标准偏差(s)。

结果表明:当超声聚合时间在10～40 min时,显色斑点R、G、B值的s分别为2.0～4.1,1.6～2.4,2.6～4.5,出现明显波动;超声聚合45 min后,R、G、B值的s分别为1.6～2.0,0.8～1.6,1.6～2.1,结果稳定性变好。这是由于超声聚合时间较短,印迹聚合物聚合不充分,重现性不好。因此,试验选择的超声聚合时间为45 min。

2.2.3 洗脱剂

试验考察了分别以水、60%(体积分数,下同)乙醇溶液、体积比为9∶1 的甲醇-乙酸混合溶液、0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液为洗脱剂时对模板分子的洗脱效果。结果发现:在365 nm 紫外灯下,水洗脱后的纸芯片上可观察到明显的显色斑点;60%乙醇溶液洗脱后,纸芯片上残留少量显色斑点;体积比为9∶1的甲醇-乙酸混合溶液和0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液洗脱后,纸芯片上未观察到显色斑点。这与芦丁在洗脱剂中的溶解度有关,溶解度越大,洗脱效果越好。芦丁易溶于甲醇和氢氧化钠溶液,因此这两种洗脱剂的洗脱效果较好。考虑到甲醇为有毒试剂,而且乙酸浓度较高,后续纸芯片洗至中性所需水量较大,而0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液洗脱后,纸芯片洗至中性所需水量少;并且试验发现随着氢氧化钠浓度的增大,芦丁越容易被洗脱,但浓度不能过高,否则会腐蚀滤纸。综上分析,试验选择的洗脱剂为0.01 mol·L-1氢氧化钠溶液。

2.3 显色条件的优化

2.3.1 点样体积

分别在制备好的芦丁分子印迹纸芯片上滴加0,2,4,5,6,8,10μL 的0.100 0 g·L-1芦丁标准溶液,考察了显色斑点R、G、B 值的变化情况,平行测定3次,分别计算R、G、B值的平均值和s。

结果表明,当点样体积为4～6μL 时,R、G、B值的s均不大于2.0,变化小,结果重现性好。这是由于点样体积过少时,溶液未完全浸没检测区,而当点样体积过大时,会造成边界的显色物质浓度水平增大,说明点样体积过小或过大都会造成斑点显色不均匀,重现性差。综合考虑,试验选择的点样体积为5μL。

2.3.2 反应时间

试验考察了反应时间分别为8,10,15,20,25,30,40,60,120 min时显色斑点R、G、B值的变化情况,平行测定3次,分别计算R、G、B 值的平均值和s,结果见图2。

图2 反应时间对显色斑点R、G、B值的影响Fig.2 Effect of the reaction time on R,G and B values of the chromogenic spot

由图2可知:当反应时间在8～30 min时,R、G、B 值波动较大;反应40 min后,显色斑点的R、G、B值趋于稳定,并且反应120 min时仍较稳定,说明该荧光体系稳定性较好。因此,试验选择的显色反应时间为40 min。

2.4 标准曲线和检出限

按照试验方法,在芦丁分子印迹纸芯片检测区滴 加0,0.010 0,0.020 0,0.030 0,0.040 0,0.050 0 g·L-1芦丁标准溶液,拍照,获得R、G、B值。以0 g·L-1芦丁标准溶液为空白,以芦丁质量浓度为横坐标,不同数学模型(其中ΔR＝R-R空白,ΔG＝G-G空白,ΔB＝B-B空白)为纵坐标建立标准曲线。对于相关系数大于0.995 0 的标准曲线,以11次空白测定值的3倍s与线性回归方程斜率(k)的比值计算检出限(3s/k),结果如表1所示。

表1 不同数学模型下的线性回归方程、相关系数和检出限Tab.1 Linear regression equations,correlation coefficients and detection limits under different mathematical models

通过比较各标准曲线的相关系数和检出限,发现数学模型R＋G＋B 和R＋G 的相关系数均大于0.998 0,说明这两个模型的回归方程线性较好,并且R＋G＋B模型所得检出限远低于R＋G 的,说明前者的灵敏度更高。因此,试验选择以R、G、B 值之和为纵坐标建立标准曲线。继续梯度增加芦丁标准溶液质量浓度,发现当芦丁质量浓度为0.010 0～0.200 0 g·L-1时,R、G、B 值之和与芦丁质量浓度依旧呈线性关系,线性回归方程为y＝1 100x＋489.2,检出限为0.007 9 g·L-1。

2.5 回收试验

按照试验方法对芦丁待测液进行加标回收试验,结果如表2所示。

表2 回收试验结果Tab.2 Results of test for recovery

由表2可知,芦丁的回收率为82.6%～105%。

2.6 样品分析

按照试验方法对某产地不同批次的槐花样品平行测定5次,计算测定值的相对标准偏差(RSD),结果如表3所示。

表3 样品分析结果(n＝5)Tab.3 Analytical results of the samples(n＝5)

本工作将分子印迹技术与纸芯片结合,基于智能手机数码成像的功能,提出了分子印迹纸芯片快速测定槐花中芦丁含量的方法。在优化的试验条件下,芦丁的质量浓度在0.010 0～0.200 0 g·L-1内与其荧光显色图片的R、G、B 值之和呈线性关系。该方法所需试剂量少、成本低廉、简便快速,能满足现场快速分析的需求。

致谢:感谢湖北省优势特色学科群“资源环境与智能化工程”项目对本工作的资助。