胆管癌中PTEN表达与其对雷公藤红素敏感性的研究*

钟 琳, 潘宇飞, 董立巍, 肖 峰, 曹瑞平, 颜红柱△

1上海中医药大学附属第七人民医院病理科,上海 200137 2海军军医大学国家肝癌科学中心,上海 201112

胆管癌是一种具有高度异质性的胆道系统恶性肿瘤,起病隐匿,早期诊断困难,可选择药物少,放化疗易产生耐药,预后较差,其全球范围内发病率和死亡率均逐渐上升[1-3]。胆管癌在我国高发,且其发病率呈逐年上升趋势,已成为威胁我国人民身体健康的重要因素[4]。因此,临床上迫切需要新的胆管癌治疗药物,改善胆管癌治疗现状。研究发现,人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome 10,PTEN)在胆管癌中存在较高比例的缺失(约40%)[5],关于PTEN蛋白的缺失与胆管癌发生、进展及预后相关性的研究较少,值得探讨。

雷公藤红素是中草药雷公藤的主要成分之一,对多种类型的人类肿瘤,如卵巢癌[6]、宫颈癌[7]、骨髓瘤[8]、神经胶质瘤[9]等,均有治疗效果,其抗癌机制可能包括以下方面:①诱导细胞凋亡和自噬,②细胞周期阻滞,③抗转移和抗血管生成,④抗炎,⑤抗氧化[10-11]。雷公藤红素可以靶向多种信号通路和分子,如活性氧(ROS)/JNK、Akt/mTOR[12-13]、AMPK[14]、NF-κB[15]、STAT3/JAK2[16]、HSP90[17]、ERα[18]、VEGFR[19]、STAT3[20]、促炎性细胞因子[21]、粘附因子[22]等。

有趣的是,PTEN与雷公藤红素的多个作用靶点之间存在关联。已有研究报道,PTEN的缺失能够激活AMPK[23]、NF-κB[24],并诱导VEGFR表达[25]。敲低PTEN表达可诱导促炎细胞因子,如IL-6、CXCL8、CCL2和CCL5的产生[26]。阻断PTEN可拮抗雷公藤红素对胆管癌细胞中PI3K/Akt信号通路的抑制[12]。而胆管癌中存在高频的PTEN缺失突变。由此,我们考虑雷公藤红素治疗胆管癌(尤其是PTEN缺失型)是否具有可行性。本研究分析了不同PTEN表达水平的胆管癌患者的预后差异,并观察PTEN差异表达的胆管癌细胞系对雷公藤红素敏感性的差异,探讨PTEN表达与胆管癌细胞对雷公藤红素敏感性的关系。

1 材料与方法

1.1 患者资料及临床研究方法

本研究纳入2015年1月至2017年12月期间,海军军医大学附属东方肝胆外科医院收治的胆管细胞癌患者65例,对所有手术切除组织均进行组织病理学检查,由3位经验丰富的病理学专家分别独立进行检查,并获得共识。本研究获得海军军医大学东方肝胆外科医院伦理委员会的批准,研究纳入的所有胆管细胞癌患者均在术前签署了知情同意书。其中,男性43例(66.2%),女性22例(33.8%),男女比例为1.95∶1,发病年龄为34～76岁,中位发病年龄为55岁,平均年龄为53岁。随访75人,失访10人。所有患者出院后均依据本院标准随访流程进行定期随访:术后前2年内每3月随访一次,术后2年以后每3～6个月随访一次。

1.2 胆管癌细胞系来源

人胆管癌细胞系RBE、HCCC-9810购自中国科学院上海细胞库;TFK1由华中科技大学同济医学院附属同济医院邹声泉教授惠赠。

1.3 主要试剂及材料

雷公藤红素(Celastrol)(Selleck公司);CellTiter-GloTMLuminescent Cell Viability Assay Kit(Promega公司);RPMI 1640培养液、抗生素(庆大霉素、链霉素、青霉素)(上海源培生物科技公司);0.5% Typsin-EDTA(Gibco公司);PierceTMBCA蛋白检测试剂盒(Thermo Pierce公司);PTEN抗体(Cell Signaling Technology公司)、β-actin抗体(Abclonal公司)。对照腺病毒(NC)、PTEN过表达腺病毒(Ad-PTEN)由汉恒生物科技有限公司提供。

1.4 实验方法

1.4.1 免疫组化染色及评分 所有组织标本经4%中性甲醛固定,石蜡包埋,常规切片、脱蜡,柠檬酸缓冲液微波抗原修复,一抗室温下培养1 h,二抗室温下孵育30 min,通过DAB染色,苏木精复染,无水乙醇脱水,中性树胶密封观察。结果判定PTEN阳性部位为细胞质,判读使用染色强度与阳性细胞百分比二级计分法。染色强度:无着色计0分,淡黄色计1分,黄色或深黄色计2分,黄褐色或棕褐色计3分。阳性细胞所占百分比:无阳性细胞计0分,阳性细胞1%～计1分,26%～计2分,51%～计3分,>75%计4分。最终评分为两者乘积,得分≤3分判读为低表达/缺失,>3分判读为高表达。

1.4.2 细胞培养 用含10%血清及青霉素、链霉素、庆大霉素的RPMI 1640培养液培养细胞,置于37℃、5% CO2恒温细胞培养箱内培养。

1.4.3 Western blot检测 Western blot检测胆管癌细胞系HCCC-9810、TFK1、RBE中PTEN表达情况。RIPA裂解液裂解细胞,提取蛋白,100℃变性后,SDS-PAGE蛋白电泳分离蛋白,湿转法将蛋白从SDS-PAGE分离胶上转移至NC膜,5% BSA室温封闭1 h,加入抗PTEN和抗β-actin一抗(稀释度均为1∶1000)室温孵育2～3 h,1 × TBST清洗NC膜,荧光二抗室温避光孵育1 h,1 × TBST清洗NC膜,最后用荧光扫描仪(Odyssey,LI-COR公司)对蛋白条带进行半定量分析。

1.4.4 CellTiter细胞活力检测 按1×104个/孔的数目,将细胞接种至96孔白色底透板,每个处理组至少设置3个复孔。待细胞贴壁后予以雷公藤红素处理,放回37℃、5% CO2恒温孵箱继续培养24 h。将CellTiter试剂在室温下融化后和无血清培养液按照1∶3的比例配制混合液,按100 μL/孔加入各孔培养细胞中,37℃孵育15 min,用多功能酶标仪测量各孔在620 nm波长下的吸光度值,计算药物对不同细胞的IC50值。

1.4.5 腺病毒感染 Enhanced Infection Solution试剂溶解腺病毒(购自吉凯基因公司)。将细胞接种至细胞培养皿/孔板,待细胞贴壁后加入适量的已稀释至适宜浓度的腺病毒(载体:pENTER-His-Flag-PTEN;滴度:1 × 10E10 VP/mL;MOI:3～5)。感染36～48 h后进行后续实验。

1.4.6 原代人胆管癌细胞(patient-derived tumor cells,PDCs)分离与培养 获取手术切除的原代胆管癌肿瘤组织并置于原代组织原液中。在无菌条件下机械分离组织,接着在37°C下用胶原酶Ⅰ(10 mg/mL;Sigma-Aldrich公司)和胰蛋白酶(0.10%;Sigma-Aldrich公司)孵育60 min;经100 mm无菌过滤器过滤;用低渗透红细胞溶解缓冲液(eBioscience公司)消除红细胞;将新鲜分离的PDCs在基质涂层培养板中培养。细胞培养液:在RPMI 1640培养液中添加2 mmol/L谷氨酰胺(Invitrogen公司)、20%胎牛血清(FBS,Gibco公司)、1 μmol/L地塞米松(Sigma-Aldrich公司)、人表皮生长因子(40 ng/mL,PeproTech公司)、人成纤维细胞生长因子(FGF,20 ng/mL,PeproTech公司)、人胰岛素(5μg/mL,Sigma-Aldrich公司)、青霉素(100 U/mL,Gibco公司)和链霉素(100 μg/mL,Gibco公司)。通过换液去除悬浮生长的细胞,通过传代去除不具有高度增殖能力的细胞。

1.5 统计学方法

使用SPSS 25.0以及GraphPad 8.0对数据进行统计分析,通过Kaplan-Meier生存曲线分析胆管癌患者的生存期与PTEN表达水平的关系,利用Log-rank法比较PTEN低表达和高表达组患者的生存率差异,以P< 0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 胆管癌组织中PTEN的表达与患者预后相关

免疫组织化学检测65例胆管癌组织样本,其中PTEN高表达32例(32/65),占49%,低/缺失表达33例(33/65),占51%。进一步分析PTEN表达与胆管癌患者预后的关系,发现PTEN缺失/低表达组患者的总体生存期(OS)与无病生存期(DFS)均显著低于PTEN高表达组(P< 0.01)(图1)。

2.2 PTEN差异表达的胆管癌细胞对雷公藤红素的敏感性不同

2.2.1 PTEN在不同胆管癌细胞系中差异表达 Western blot法检测3种胆管癌细胞系HCCC-9810、TFK1、RBE中PTEN蛋白表达情况,发现胆管癌细胞系HCCC-9810中PTEN表达缺失,而RBE细胞中PTEN高表达(图2)。

2.2.2 不同的胆管癌细胞系对雷公藤红素敏感性不同 利用CellTiter试剂检测不同胆管癌细胞系对雷公藤红素的敏感性,发现胆管癌细胞系RBE IC50值最高,为(1.922 ± 0.719)μmol/L;其次是TFK1细胞系,为(0.637 ± 0.066)μmol/L;HCCC-9810细胞系IC50值最低,为(0.584 ± 0.052)μmol/L(图3A)。进一步在光镜下观察不同胆管癌细胞系经雷公藤红素(2 μmol/L)处理5 h后的形态变化,与上述结果一致,HCCC-9810细胞系对雷公藤红素最敏感,而RBE细胞系最不敏感(图3B)。

2.2.3 过表达PTEN降低HCCC-9810细胞对雷公藤红素敏感性 利用腺病毒Ad-PTEN在HCCC-9810细胞中过表达PTEN,利用CellTiter试剂检测细胞对雷公藤红素的敏感性,发现Ad-PTEN组HCCC-9810细胞对雷公藤红素的敏感性减弱(图4A)。光镜下观察对照组与Ad-PTEN组HCCC-9810细胞经雷公藤红素(2 μmol/L)处理5 h后的形态变化(图4B),与图4A的结果一致,说明过表达PTEN降低了HCCC-9810细胞系对雷公藤红素的敏感性。

2.2.4 PTEN缺失的原代人胆管癌细胞对雷公藤红素敏感 我们分离培养原代人胆管癌细胞(PDCs),通过Western blot检测PTEN表达情况,继而检测PTEN表达/PTEN缺失的PDCs经雷公藤红素处理后的细胞活力,发现PTEN缺失的PDCs对雷公藤红素较为敏感(图5)。

3 讨论

PTEN又名人10号染色体缺失的磷酸酶及张力蛋白同源基因,是PI3K/AKT/mTOR信号通路的主要负调节分子[27],能够调控细胞增殖、生长、生存和代谢等细胞过程[28-30]。有文献报道,在多种人类肿瘤中存在PTEN突变,如结直肠癌[31]、胶质母细胞瘤[32]、乳腺癌[33]、前列腺癌[34]。另有研究发现胆管癌临床组织样本中存在高频的PTEN突变[5]。本研究发现,在胆管癌组织样本中PTEN存在一定比例的缺失/低表达,与文献报道一致,且该组患者预后较差,但其具体机制不详,推测PTEN可能通过PI3K/Akt/mTOR信号通路影响肿瘤恶性进程,进而影响胆管癌患者预后。

雷公藤,系指卫矛科植物雷公藤干燥根的木质部,归肝、肾经,性苦、辛,有大毒;功能祛风除湿,杀虫止痒,活血通络,消肿止痛,解毒杀虫;临床用于治疗风湿、类风湿性关节炎等多种自身免疫性疾病。雷公藤红素是中草药雷公藤的主要成分之一,药理学研究发现雷公藤红素具有抗炎、免疫抑制、抑制细胞增殖、促进细胞凋亡等多种功能。雷公藤红素对肺癌、胃癌、胰腺癌、乳腺癌、白血病等多种癌症具有抗肿瘤作用[35-39]。研究发现,雷公藤红素可以通过多种途径诱导凋亡进而杀伤肿瘤细胞[35-37]。

本研究中,我们发现PTEN差异表达的胆管癌细胞系对雷公藤红素的敏感性不同,PTEN野生型胆管癌细胞系RBE对雷公藤红素不敏感,PTEN缺失型胆管癌细胞系HCCC-9810对雷公藤红素较敏感,提示雷公藤红素应用于治疗PTEN缺失/低表达胆管癌患者具有一定可行性。但PTEN能否调控胆管癌细胞对雷公藤红素的敏感性,是否通过调控PI3K/Akt/mTOR信号通路影响雷公藤红素对胆管癌的杀伤作用,其具体机制仍待更进一步深入研究。