黄芪甲苷对氯吡格雷致大鼠胃黏膜损伤的治疗作用及机制

张静，张秋瓒，王艳荣

天津市第四中心医院 南开大学附属第四中心医院消化内科，天津 300140

目前缺血性心脑血管疾病的发病率及病死率逐渐上升，抗血小板治疗是缺血性心脑血管疾病治疗的常规及有效措施。但是抗血小板治疗是一把双刃剑，有效预防及治疗缺血性疾病的同时，也可引起胃肠道并发症。黄芪是最常用中药之一，从黄芪中分离出来的皂苷已有数十种，而甲苷为其主要的活性指标成分。2021 年3 月—2022 年1 月，我们探讨黄芪甲苷对氯吡格雷所致胃黏膜损伤大鼠的治疗作用及可能的机制，以期为临床治疗及预防抗血小板药物引起的胃肠道不良反应提供参考。

1 材料与方法

1.1 动物、试剂及仪器 健康雄性6 周龄SD 大鼠50 只，体质量180～200 g，中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心提供及饲养。温度（24 ± 2）℃，湿度（55 ± 5）%，噪音＜50 db，每12 小时1 次亮暗循环，每笼10只，平衡饲料分笼饲养1周。硫酸氢氯吡格雷（波立维）购自赛诺菲万安特制药有限公司；黄芪甲苷购自上海圻明生物科技有限公司；血管内皮细胞生长因子（VEGF）单克隆抗体（兔IgG）、磷酸化血管内皮细胞生长因子受体2（p-VEGFR2）单克隆抗体（兔IgG）一抗试剂盒购自武汉博士德生物工程有限公司。Image Pro Plus 显微图像分析与处理系统购自青岛美迪康医疗科技有限公司。

1.2 动物分组及干预 将大鼠随机分为对照组、模型组及黄芪甲苷低、中、高剂量组，每组10 只，参考大鼠与人折算系数分别予生理盐水1 mL/100 g、氯吡格雷15.6 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黄芪甲苷15 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黄芪甲苷30 mg/kg、氯吡格雷15.6 mg/kg+黄芪甲苷60 mg/kg 灌胃，每日1次，干预1周后脱颈处死大鼠［1］。

1.3 观察指标与方法

1.3.1 胃黏膜损伤评价 取各组胃壁组织，漂洗干净后，按文献［2］标准进行评价。斑点糜烂1 分；糜烂长度＜1 mm 计2 分、1～＜2 mm 计3 分、2～4 mm 计4分、＞4 mm 计5 分。糜烂宽度＞1 mm 时分值×2，各分值相加为损伤指数总分。

1.3.2 胃黏膜组织中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表达检测 取胃窦部黏膜组织0.2 g，加入9 倍生理盐水，制成10%胃黏膜组织匀浆，3 500 r/min 常温离心15 min。剪下大小约1 cm×1 cm 胃窦黏膜组织，于液氮中冷冻保存，然后于-80 ℃冰箱保存备用。采用免疫组化SABC 染色法［3］，用4%多聚甲醛外固定胃黏膜标本，染色、透明和封片。将切片用0.5%甲醇液在室温下浸泡30 min，蒸馏水洗，热修复，滴加正常山羊血清封闭液，室温保存20 min。滴加VEGF、p-VEGFR2 组织一抗（稀释比例1∶150），4 ℃过夜。PBS 冲冼滴加生物素化山羊抗兔IgG，37 ℃ 20 min，用PBS 冲洗，滴加SABC，20～37 ℃ 20 min，PBS漂洗，DAB显色，蒸馏水洗涤，脱水，透明，封片，显微镜（×200）下观察。阴性对照组用PBS 代替一抗。用Image-Pro Plus 分析免疫组化图片，每张切片随机选择5个高倍视野，进行图像分析，观察每个视野下阳性反应的光密度及阳性细胞面积［4］。免疫组织化学结果判定标准：胃黏膜上皮细胞及内皮细胞胞质内出现棕黄色颗粒为阳性表达。

1.4 统计学方法 采用SPSS22.0 统计软件。符合正态分布的计量资料以±s表示，多组比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD 法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组胃黏膜损伤情况比较 50 只大鼠均存活。对照组、模型组及黄芪甲苷低、中、高剂量组胃 黏膜损伤指数评分分别为0、（10.85 ± 1.43）、（8.76 ± 1.53）、（6.48 ± 1.27）、（3.69 ± 0.87）分。与对照组比较，模型组胃黏膜损伤指数评分高（P＜0.05）；与模型组比较，各黄芪甲苷组胃黏膜损伤指数评分低（P均＜0.05）。黄芪甲苷低、中、高剂量组胃黏膜损伤指数评分比较差异有统计学意义（P均＜0.05）。

2.2 各组胃黏膜组织中VEGF、p-VEGFR2 蛋白表达比较 见表1。

表1 各组胃黏膜组织中VEGF、p-VEGFR2蛋白表达比较（±s）

表1 各组胃黏膜组织中VEGF、p-VEGFR2蛋白表达比较（±s）

注：与对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，#P＜0.05；与黄芪甲苷低剂量比较，&P＜0.05；与黄芪甲苷中剂量比较，△P＜0.05。

组别对照组模型组黄芪甲苷低剂量黄芪甲苷中剂量黄芪甲苷高剂量n 10 10 10 10 10 VEGF蛋白阳性面积（μm2）2 730 ± 310 1 120 ± 110*1 410 ± 130#2 015 ± 210#&2 540 ± 260#&△光密度0.319 ± 0.018 0.132 ± 0.009*0.160 ± 0.010#0.214 ± 0.010#&0.288 ± 0.014#&△P-VEGFR2蛋白阳性面积（μm2）4 021 ± 420 2 011 ± 201*2 502 ± 203#3 060 ± 245#&3 785 ± 320#&△光密度0.396 ± 0.022 0.164 ± 0.009*0.185 ± 0.102#0.303 ± 0.012#&0.376 ± 0.020#&△

3 讨论

目前，口服阿司匹林联合P2Y12 受体抑制剂的双抗疗法是急性冠脉综合征及冠脉支架置入术后患者的首选［5］。P2Y12 受体是抗血小板药物发挥作用的重要靶点。氯吡格雷是目前临床上应用最广泛的P2Y12 受体抑制剂之一，它通过肠道吸收后生成能抑制血小板聚集的活性代谢物［6］，起到抗血栓形成的作用。使用氯吡格雷75 mg/d 者与使用阿司匹林100 mg/d 者胃肠道出血风险相当［7-8］。二者合用引起的上消化道出血风险是二者单一用药的2～4倍［9］。接受抗血小板治疗的患者都发生了胃肠道损伤［10］。有研究报道，氯吡格雷可能通过细胞因子、炎症介质及信号通路等导致胃黏膜损伤［11］。我们前期研究也证实它可以通过影响炎症细胞因子水平引起胃黏膜损伤。

黄芪甲苷可以通过改变胃黏膜上皮细胞超微结构发挥保护胃黏膜屏障完整性的作用；也可以通过调节炎症细胞因子及相关信号通路，对损伤胃黏膜起到保护作用［12-13］。李建芝等［14］研究发现，黄芪甲苷可以通过抗氧化、抑制细胞凋亡等机制修复胃黏膜损伤。黄芪甲苷可通过抑制MAPK信号通路激活来抑制胃黏膜炎症反应，发挥胃黏膜保护作用［15］。本研究发现，氯吡格雷可以引起大鼠胃黏膜损伤，黄芪甲苷可以参与损伤胃黏膜的修复，且随着剂量增加，修复作用逐渐增强。

VEGF 是一种促血管生成活性的生长因子，具有促有丝分裂、抗内皮细胞抗凋亡、增加血管通透性、促进细胞迁移等作用，可促进新生血管的形成［16］。VEGF 是参与消化性溃疡愈合的关键因子，可通过促进细胞外基质堆积，参与溃疡的愈合及血管再生［17］。VEGF 受体包括三种，其中VEGFR1、VEGFR2 主要分布于血管。VEGF 可以与VEGFR2特异性结合，VEGFR2在介导内皮细胞增殖、迁移等方面发挥重要功能［18］。研究发现，氯吡格雷通过抑制VEGF-VEGFR2-EPK 信号转导，抑制胃溃疡血管形成，从而延迟溃疡愈合［19］。本研究发现，应用氯吡格雷后大鼠胃黏膜组织中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表达下降，而应用黄芪甲苷后大鼠黏膜组织中的VEGF、p-VEGFR2 蛋白表达升高。提示氯吡格雷可以通过抑制VEGF、p-VEGFR2 表达对胃黏膜造成损伤，而黄芪甲苷可以促进二者表达，从而减轻氯吡格雷引起的胃黏膜损伤。

综上所述，黄芪甲苷对氯吡格雷所致胃黏膜损伤具有一定治疗作用，其作用机制可能与上调胃黏膜组织VEGF、P-VEGFR2 表达保护胃黏膜屏障有关。