烟草中农药残留检测前处理技术评估及应用效果

杨惠娟, 苏国权, 赫英宇, 李帅兵, 张玉娟, 李静静, 申洪涛

(1.河南农业大学烟草学院,河南 郑州 450046; 2.黑龙江省烟草公司牡丹江烟叶公司,黑龙江 牡丹江 157000;3.联一国际烟叶公司,云南 昆明 65000; 4.河南中烟工业有限责任公司技术中心,河南 郑州 450046)

农药是烟草生产中重要的外源有害物质之一。由于农药使用方式及用量的不合理,农药残留超标问题极易发生,造成烟草的品质安全问题,严重威胁人类健康。因此,农药残留问题逐渐受到各方面的广泛关注[1]。农药残留超标问题也严重影响了中国烟草的发展和烟草制品出口[2-4]。由于使用的农药种类繁多,导致烟草中农药残留检测分析相当复杂。因此,具有灵敏度高、操作简捷、适用于烟草中多种农药残留检测的前处理,对确保烟草和烟草产品的安全具有重要意义。

前处理技术是农药残留检测分析的关键步骤,它关系到检测的准确度和精密性[5]。不仅要尽量完全提取出样品中的待测组分,还要去除样品中的杂质以降低样品中杂质对待测结果的干扰,提升检测的灵敏度和准确性。传统前处理技术缺陷较多,如样品需求量大、试剂消耗量大、毒性大、操作繁琐等[6]。因此,需要开发操作简便、迅速、效率高的烟草农药检测前处理技术。

现有的农药残留检测前处理技术受到自身局限或者有效材料等问题局限,在实际应用中存在不足。积极探讨各种高效、先进的前处理方法,发展高效的农药残留检测技术,是满足当前烟草农残检测及烟草生产安全的迫切需求。

1 现阶段烟草农药残留物的概况

1.1 中国烟草生产中使用的农药种类

目前,中国烟草上已发现的侵染性病虫害达280余种[7]。现今中国烟草生产过程中使用的农药,主要用于杀虫、杀菌、除草等,并且各种农药的使用方法和剂量参差不齐。据中国农药信息网统计,2022年底中国批准在烟草种植上施用的农药产品共有806个,有效成分133种[8]。

烟草大田生长期间,大量农药被广泛应用于病虫害的防治。其中,杀虫剂是使用比例最大的农药,占总用量将近70%[9]。有机氯类、有机磷类、氨基甲酸酯类、拟除虫菊酯类和新烟碱类农药[10]为最常见的杀虫剂。有机氯类和拟除虫菊酯类农药是残效期较长、稳定性较强的农药[11]。牛柱峰等[12]在对山东五莲烟区的烟叶进行研究时发现,烟叶中存在有机氯和拟除虫菊酯类杀虫剂,且发现部分烟叶中有机磷类杀虫剂残留较高。有机磷类农药[13-14]多达百余种,其凭借高效、易降解、使用方便等优点,成为目前世界范围内应用最为普遍的一类杀虫剂。氨基甲酸酯类农药是以甲酸酯为前体化合物发展而来的农药,这种农药分解速率快,残留期相对较短,并且具有毒性低、高效性和选择性强的特点[15]。新烟碱类农药自20世纪90年代首次获批登记以来,以高效、广谱、低毒的特性及新颖的作用方式、良好的吸收性等特点,被农药市场广泛接受[16]。到目前为止,中国登记的新烟碱类农药已有2 100余种,约占中国登记农药药品总数的7%[17]。

烟田中生长的杂草生长能力较强,借此争夺烟株养分,直接影响着烟株的正常生长[18]。为了去除杂草保障烟株的正常发育,烟农常常施加大量除草剂。研究表明,烟草中造成农药残留的除草剂种类主要包括喹啉羧酸类[19]、苯氧羧酸类、苯甲酸类、磺酰脲类、酰胺类[20];截至2020年8月,登记在烟草上的除草剂有效成分有敌草胺、精异丙甲草胺、异丙甲草胺、二甲戊灵、仲丁灵、异噁草松[21]、砜嘧磺隆、精喹禾灵、高效氟吡甲禾灵、烯草酮和威百亩11种[22],同时二甲戊灵、仲丁灵也是常见的植物调节剂的有效成分[23]。

国家烟草专卖局调查表明,烟草常见的病害主要有烟草花叶病毒病、赤星病[24]、黑胫病、蚜传病毒病、青枯病[25]、根结线虫病[26]、野火病[27]、脚斑病、白粉病。烟草病害防治的主要药剂类型为化学杀菌剂,常见的杀菌剂主要有青枯灵、硫酸链霉素[28]、氟啶胺[29]、噻唑锌[30]、代森联、丁吡吗啉[31]、多菌灵等。

1.2 烟草农药限量标准

在烟草种植、采收、烘烤或晾晒环节,如果处理不当,烟草容易被农药污染。由于农药残留严重影响人类健康,许多国家、地区、国际组织都相继制定了农药残留限量标准,国际市场烟叶的选购和评价标准之一为制品中的农药残留量。1986年,德国制定了卷烟和烟丝中的18种农药残留,烟叶原料中71种农药残留量的最高限量[32];美国农业部则在1987年制定了进口烟草中19种农药残留限量指标[33]。综合来看,美国、德国等欧美国家制定的国家标准,对烟草中农药残留最高限量做出规定的多达150余种农药[34]。2008年国际烟草科学研究合作中心(CORESTA)农用化学品咨询委员会(ACAC)提出118种烟草常用农药的指导性残留限量(GRLs)[35],2016年CORESTA(烟草科学合作研究中心)召开会议提到106种烟草农药残留,主要包括有机磷类、氨基甲酸酯类、生长调节剂类及有机氯类农药[36]。

中国农药残留限量标准相关工作起始时间相对较晚,2009年前中国烟草农药残留检测是参照国际水果蔬菜或烟草农残限量标准,随着中国烟草及烟草制品在国际市场受到越来越多的认可,烟草中的农药残留也备受关注。2009年7月,国家烟草专卖局科教司、中国烟草总公司及烟草质量监督检验中心等系统研究了烟草农药最大残留限量,并且还根据喷洒杀虫剂的类型、剂量和频率制定了13项烟草标准[37]。国家烟草专卖局还提出了“无公害烟草生产技术”,重点控制烟草中的农药和重金属残留[38-39]。截至2019年,中国批准在烟草上登记,并在有效期的农药共有133种[40]。中国地域辽阔,烟草种植面积广阔,施用的农药种类多,建立完整烟草农药残留的限量标准,是提高中国烟草质量安全的重中之重。

1.3 烟草农药残留现状

烟草在生产种植过程中,悬浮剂、乳油等直接喷洒于烟草叶面剂型的农药会导致严重的农药残留,造成农药残留超标的主要原因就是滥用农药、施用剂量超标[41]。据统计,中国在烟草种植上施用的农药主要是有机磷类[42]、拟除虫菊酯类[43]、氨烷类及有机氯类[44],吡蚜酮[45]、多菌灵[46]、高效氯氟氰菊酯[47]、三嗪类杀虫剂[48]和马来酰肼[49]等,其中有机氯类农药稳定性强、难降解。中国在1983年全面禁止六六六和滴滴涕等主成分为有机氯类的化学农药使用,但检测中经常能够检测出残留成分。这是由于有机氯类农药能够在土壤中残留极长时间,烟草能够富集残留在土壤中的农药成分,导致烟草农残超标。

现阶段中国烟草农药残留存在的主要原因是大田生产过程中主要采取化学制剂处理病虫害,农药施入烟田后,部分扩散到大气环境中进而进入烟株内部,另外一部分则会被烟株吸收进入烟株内部[50]。而烟株自身能够分解农药成分的酶的氧化分解能力有限,因此直至收获,烟草中仍残留少量农药成分,甚至有毒代谢产物[51]。在烘烤和风干过程中,烟草农药残留主要是未完全分解的农药及其有毒代谢物。虽然烟草在储存期间会分解以减少农药残留,但在储存期间喷洒防虫药会产生新的农药残留。

2 农药残留检测前处理技术评估

在烟草农药残留检测试验中,科学、准确、高效的前处理技术可以显著提高样品农药残留量的提取率,避免了包含干扰性杂质对试验结果产生的影响。当前,前处理方法主要应用的技术有固相萃取技术、固相微萃取技术、分子印迹微萃取技术、基质固相分散技术与分散固相萃取技术等[52]。

2.1 固相萃取技术(SPE)

固相萃取技术(solid phase extraction,SPE)是近些年发展的前处理技术,其原理是利用液相色谱法的分离原理。先使用固体吸附剂选择性吸附农药成分,除去样品基质和干扰化合物,再使用洗脱剂将农药洗脱下来的方法。固相萃取技术是一种通用型样品前处理技术。相较于其他前处理技术,固相萃取技术在农药残留前处理上应用最为广泛,但此项技术对操作要求高,步骤复杂,消耗溶剂量大,一般应用于有机氯农药检测等可用液相色谱法检测的农药样品的前处理中。马凯等[53]采用磁性固相萃取技术,建立了一种兼具简便可靠两大特点的测定烟草中9种农药残留量方法,其中Zr-金属有机骨架功能化磁性石墨烯纳米复合材料的合成成为其快速测定烟草中多种农药残留的吸附剂。曹建敏等[54]曾用固相萃取技术检测过烟草中40种农药残留,回收率在75 %之上,此项技术价格便宜、试验误差小,对烟草挥发性与极性农药回收率较高,检测下限可低至0.01 mg·kg-1,薛晓康等[55]利用四氧化三铁负载石墨化碳黑磁性纳米材料(GCB/Fe3O4)作为固相萃取吸附剂,与气相色谱/三重四极杆串联质谱技术(GC-MS/MS)联用同时测定了茶叶中405种农药的残留,发现平均回收率达到48.2%～123.6%。

2.2 固相微萃取技术(SPME)

固相微萃取技术(solid-phase microextraction, SPME)是以固相萃取技术为基础的进一步发展的新型无溶剂化样品前处理技术,其核心为固相微萃取纤维。根据萃取方式以及萃取装置不同分为多种萃取方法。SPME集采样、萃取、浓缩、进样于一体,拥有萃取性能好、稳定性高、操作简便等优点,适用于多种农药残留的快速筛查。SPME萃取时间短,提取结果准确性高。刘苗等[56]使用固相微萃取技术进行前处理后,测出了蔬菜中有机磷类和拟除虫菊酯类共23种农药残留。使用固相萃取技术进行前处理时,吸附剂的选择至关重要,近年来,碳纳米管作为吸附剂用于固相萃取前处理在农药残留、药物、酚类化合物分析上得到了广泛的应用[57]。RAVELO-PÉREZ等[58]利用10～15 nm直径的多壁碳纳米管作为吸附材料和GC联用测定了苹果等几种水果中中二嗪磷、杀螟硫磷等8种有机磷的残留,回收率为73 %～103 %,低于欧盟建立的农药残留限量标准。选用吸附力强、化学性质稳定、机械强度高的吸附材料是提高固相萃取和固相微萃取技术的关键。

2.3 分散固相萃取技术(d-SPE)

BARKER[59]最先提出分散固相萃取技术,他采用包含有C18在内的多种聚合物作为萃取材料,然后使用不同溶剂将农药残留物洗脱下来。CAI等[60]采用分散固相萃取技术用弗罗里硅土作为基质固相分散剂,结果表明,农药回收率(拟除虫菊酯类)为72%～99%。分散固相萃取技术是一种快速的试样净化方法,其中以QuEChERS最具代表性,QuEChERS样品前处理技术凭借其快速(Quick)、简便(Easy)、便宜(Cheap)、高效(Effective)、稳定(Rugged),同时可靠安全(Safe)的特点,在农药多残留检测技术中备受关注,已获得欧盟农药残留委员会认可,在样品前处理、提取净化等方面具有良好前景,极有可能成为未来应用最为广泛的提取方法。ABDALLAH 等[61]使用QuEChERS方法和液相色谱-串联质谱法,使用酸化的乙腈和柠檬酸盐缓冲盐来提取再水合的样品,监测到了沙特阿拉伯Al-Qassim市场上的42种农药残留。孔光辉等[62]采用改进的QuEChERS技术提取烟草样品,在碱性条件下超声水解后进样分析,采用负离子多反应(离子)监测(MRM)模式检测,通过测定2,4-DNOPC 相应的水解产物 2,4-二硝基-6-(1-甲基庚基)苯酚(2,4-DNOP)来计算烟草中硝苯菌酯残留量。建立了QuEChERS-UPLC-MS/MS测定烟草中硝苯菌酯(2,4-DNOPC)残留的方法。

2.4 基质分散固相萃取技术(matrix solid phase dispersion, MSPD)

基质分散固相萃取技术是一种新型样品前处理技术,集提取与净化于一体,是将样品与固相萃取材料混合在一起,然后进行萃取进化。此项技术具有检测快、价格便宜、操作简便、试剂用量少等特点,在药物残留和有害成分分析中应用较为广泛[63]。相较于固相萃取技术,基质固相分散技术效率更高且需要的时间更短,适合固体、半固体和黏性样品的多农药残留处理。师君丽等[64]采用基质分散固相萃取净化、超高效液相色谱分离与串联质谱检测技术对烟草中131种农药及其代谢物残留进行检测,131种农药的回收率为65.3%～112.4%。该方法简便快捷,灵敏度、准确度高,极大提升了检测速率与通量。

2.5 分子印迹微萃取技术

分子印迹微萃取技术[65]是利用高度选择性聚合物,利用目标物的特异性进行分离纯化。目前常用的分子印迹萃取技术主要有分子印迹固相微萃取技术[66]、分子印迹搅拌棒吸附萃取技术[67]、分子印迹磁性微球萃取技术等。在烟草农药残留检测中,该技术主要用于研究三嗪类除草剂[68]。李方楼等[69]使用该技术对烟叶中敌草胺进行回收,其研究表明,敌草胺的回收率在90%以上,分子印迹微萃取技术是高分子生物学结合化学应用在农药残留领域的新型技术,具有特异性强,灵敏度高等优点,但由于分子印迹聚合物[70]在水相或其他极性溶剂中合成与应用受限,存在模板渗透问题,是制约分子印迹微萃取技术在农药残留分析领域推广应用的一大因素。相较于固相萃取技术和分散固相萃取技术,此项技术在烟草农药残留检测中多用于除草剂类农药前处理。选用新型功能单体如β-环糊精[71],解决分子印迹聚合物应用受限问题;使用易于模板分子洗脱的分子印迹聚合物形式,采用新型萃取方法洗脱模板分子,解决模板渗透问题;制备新型纳米材料等适合与仪器联用的分子印迹聚合物固载形式,实现分子印迹聚合物与不同分析仪器在线联用以及仪器的自动化和微型化,是分子印迹微萃取技术的未来发展趋势。

3 烟草中农药残留检测前处理技术的应用效果

3.1 烟草中农药残留检测前处理技术在植烟土壤中的应用效果

土壤是一个复杂的“类生物体”,农药在土壤中会发生如扩散或淋溶、吸附或脱附、被土壤微生物分解等一系列变化、反应。在烟草种植过程中,用于防治烟草病虫害而喷施于叶面的农药会有40%～50%沉降于土壤中[72],植烟土壤中的农药残留一部分会被降解为无毒代谢产物,一部分则会被烟株吸收。植烟土壤中农残的检测是烟草农药检测中必不可少的部分,对于植烟土壤中的农药残留检测前处理多采用分散固相萃取技术和固相萃取技术。CHEN等[73]在田间研究烟草植物和土壤中氟虫的消散动态和最终残留的试验中,采用超声辅助提取法提取了植烟土壤中氟脲类残留,采用分散固相萃取技术净化,液相色谱-串联质谱法检测,检测中回收率高于72.9%,且相对标准偏差小于12 %。WU等[74]用液相色谱-串联质谱法同时测定甲霜灵,氰唑酰胺和氰唑酰胺代谢物4-氯-5-对甲苯基咪唑-2-甲腈(CCIM)。用含有0.1%乙酸乙腈提取土壤中3种目标化合物,用十八烷基硅烷纯化提取物。该方法已成功应用于真实土壤中甲霜灵,氰唑酰胺和CCIM残留的分析。陈发元[75]采用乙酸-乙腈提取,基质固相萃取技术净化, UPLC-MS/MS和GC-ECD法测定植烟土壤中啶虫脒、砜嘧磺隆、氟节胺的残留量。结果表明,此方法的检测限啶虫脒、氟节胺、砜嘧磺隆均为0.01 mg·kg-1。啶虫脒的平均回收率为88.4%～96.9%,氟节胺的平均回收率为86.49%～97.93%,砜嘧磺隆的平均回收率为80.40%～96.70%,此种检测植烟土壤中农药残留量的方法操作简单快速,准确率高。

3.2 烟草中农药残留检测前处理技术在烟叶农药残留检测中的应用效果

烟叶中农药残留的检测,是烟草农药残留检测中的重中之重,对于保障烟叶质量安全和消费者健康有重要意义。在对烟叶中农药残留的检测前处理技术中,分散固相萃取和固相萃取技术使用最为频繁。严会会等[76]建立了一种利用LC-MS/MS快速测定烟草中15种农药如吡蚜酮等农药的方法,是采用乙腈提取样品,分散固相萃取净化,最后用LC-MS/MS进行检测的方法。随着时代的发展,检测技术也在逐渐改进和完善。翟争光等[77]利用多壁碳纳米管对烤烟样品进行净化,超高效液相色谱-串联质谱法测定烤烟中粉唑醇的残留量能够有效的解决其他检测方式过程烦琐,方法精密度及灵敏度不足的问题,为粉唑醇在烟草上的安全使用提供技术安全保障。分子印迹固相萃取技术也常用在烟草叶片农药残留检测中。王春琼等[78]构建了一种杀菌剂苯霜灵电化学检测方法:以丙烯酰胺为功能单体,应用紫外引发聚合在石墨烯修饰丝网印刷电极表面,以此来制备苯霜灵分子印迹膜。运用此方法将所制得的印迹传感器应用于烟草样品中农药残留的测定,测定结果较为理想。此种方法操作简便且检测准确,误差小,可广泛用于烟草中的农药残留检测。随着快速检测技术的发展,分子印迹固相萃取技术将与传统的实验室检测技术一样,成为农产品农药残留检测的不可替代的技术。

3.3 烟草中农药残留检测前处理技术在烟叶主流烟气农药残留检测中应用效果

烟气是不断变化的极其复杂的化学体系,它是各类烟草制品在抽吸过程中,内部化学成分经过一系列复杂变化形成的[79]。烟气根据气流的不同可分为主流烟气和侧流烟气两类。目前对植烟土壤农药残留降解动态和烤后烟叶农药残留检测方法的研究很多,但对于烤后烟叶农药残留向卷烟主流烟气中转移情况的研究较少。衡量卷烟烟气的安全性仅仅凭借烟叶中农残含量指标来衡量是不够准确的,评价卷烟烟气的安全性必须明确烟叶中农药残留向主流烟气的转移情况。卷烟烟气中农药残留的检测引起了中国学者的关注,并取得了不错的成果。

荆聪莹[80]在用直线型吸烟机进行卷烟抽吸试验中发现,主流烟气中乙草胺、氯氰菊酯、高效氯氟氰菊酯、溴氰菊酯、氰戊菊酯的转移量,均与烟叶农药残留浓度呈极显著正相关关系;抽吸容量、抽吸间隔时间的影响在一定范围内小于农药残留浓度的影响,并且在几种材料滤嘴中发现自由基清除剂滤嘴对主流烟气中的农药残留的截留作用最大。时亮等[81]以固相萃取分离纯化、气相色谱定性定量同时测定卷烟中5种氨基甲酸酯类农药(西维因、叶蝉散、速灭威、呋喃丹、灭多威)在卷烟烟气中的捕集转移率(CSE)试验中发现,此方法结果较为理想。楼小华等[82]采用硅胶固相萃取净化,色谱法检测卷烟燃吸后126种农药在主流烟气中的转移率,发现抑芽剂较高,有机氯杀虫剂、除草剂、拟除虫菊酯类杀虫剂次之,有机磷杀虫剂、杀菌剂、杂环类杀虫剂、氨基甲酸酯类杀虫剂较低。在抽吸过程中,农药残留会组成烟气气溶胶进入人体,从而影响人的身体健康。在吸烟与健康问题、卷烟安全性问题不断被提及的现阶段,烟叶烟气中农药残留的检测应该引起重视,制订成品卷烟中农药残留限量确保中国卷烟制品的安全性。

4 结论与讨论

前处理在农药残留分析中占有重要地位,前处理效果直接影响到结果的准确度。烟草的农药残留分析相较于其他基质具有以下特征:1)样品基质复杂,前处理过程步骤较多,耗时较长;2)样品中所含次生代谢物较多,种类复杂,需要更高的灵敏度;3)现阶段中国大部分地区烟草生产种植较为分散,大多为小农户生产,缺少科学的指导与规范,无法有效地对施用的农药种类进行统计,针对农药残留测定要求更高。

本研究中所介绍的固相萃取、固相微萃取、基质固相分散、QuEChERS、分子印迹微萃取技术对目标化合物的提取、富集、分离、净化的变化过程,反映出了前处理技术向适合多残留分析、自动化程度高、简易便捷、灵敏度高的方向发展。未来这种简易高效、同时可靠安全的前处理技术会得到广泛利用,如QuEChERS法;固相萃取、固相微萃取、基质固相分散这类自动化程度较高与仪器联用的前处理技术是发展的另一方向;分子印迹微萃取这种特异性强、选择性高的前处理技术是对未来发展的补充。

为提高烟草农药残留提取效率,减小基质效应,样品前处理应从以下2个方向发展:1)开拓前处理材料的功能化研究,提高萃取能力和选择性;2)增加萃取形式,提高前处理效率,由单残留向多残留检测方向发展。

针对不断变化品种的烟草农药,研究存在一定局限性。随着前处理技术的不断发展,烟草农药残留检测方法将会迎来新的契机和发展方向。