中药体外抗红色毛癣菌效应研究

苏 曼王 昊黄玉浩周文明顾 薇*陈 军

（1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023； 2.江苏省中医外用药开发与应用工程研究中心，江苏南京 210023； 3.江苏省中药资源产业化过程协同创新中心，江苏 南京 210023； 4.连云港市食品药品检验检测中心，江苏 连云港 222000； 5.安徽老孙头鞋业有限公司，安徽 宿州 235200； 6.上海杨思医院，上海 200126； 7.江苏省中药炮制重点实验室，江苏 南京 210023）

手癣、足癣中医又称鹅掌风、脚湿气，是一种常见的皮肤科真菌感染性疾病，其发病率高、难以痊愈、易反复发作、传染性强，极大影响人类健康和生活质量。足癣分为水疱型、浸渍糜烂型、角化过度型、丘疹鳞屑型，引发的致病真菌包括红色毛癣菌、絮状表皮癣菌、趾间毛癣菌、石膏样小孢子菌、犬小孢子菌等，其中红色毛癣菌是主要致病真菌，在临床检测中占80%左右，其次是须癣毛癣菌、絮状表皮癣菌等［1-5］。

目前手足癣的治疗多以西药为主，以唑类和丙烯胺类药物为代表，而西药的耐药问题是很多患者久治不愈的关键原因。中药具有来源广泛、毒副作用小、广谱、药效长等优点，可在真菌细胞内产生多方面的药理效应，而很少出现耐药，适用于病程较长的皮肤癣菌病［6］。检索2020 年版《中国药典》 《方剂大辞典》 《钦定四库全书子部·脚气治法纲要卷》及临床试验论文，筛选分析其中治疗手足癣的中药复方，结合临床医师建议，系统筛选得到26 味手足癣复方中的常用药材（表1），其以辛温、苦寒药材为主。本研究以红色毛癣菌为评价菌种，考察26 味中药的抑菌效果，对药效显著的药材进行成分分析与效应物质研究，为中药抗真菌药物的临床选用、配伍与机制研究提供科学依据。

1 材料

BSC-1604IIA2 型生物安全柜，苏州安泰空气技术有限公司；ULTROSPEC 10 CLASSIC 浊度仪，美国Harvard Apparatus 公司；B6120 型培养箱，美国Thermo Fisher 公司；Epoch2 TC 型酶标仪，美国BioTek 公司；PB21 型PH 仪，德国赛多利斯公司；AG135 十万分之一天平、XS205 型电子天平，瑞士Mettler-Toledo 公司；Ti-S 型显微镜，日本尼康公司；704767-C100002 型培养皿，青岛阿尔发医疗器械有限公司；Agilent 1260 Infinity HPLC、Agilent 6530B Accurate-Mass Q-TOF，美国Agilent 公司；超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司。Trichophyton rubrumATCC MYA-4438 购自美国ATCC 中心。

中药饮片（表1）均购自亳州紫锐药业有限公司、苏州市天灵中药饮片有限公司，由南京中医药大学药学院刘圣金副教授鉴定为正品。氟康唑（批号F8929-100MG）、MOPs（批号M1254-1KG）购自美国Sigma 公司；RPMI 1640 粉末（批号Gibco-31800-022）购自美国Invitrogen 公司；马铃薯-葡萄糖琼脂培养基（批号HB0233-12）购自青岛海博生物有限公司。土荆皮丙酸（成都格利普生物科技有限公司，批号18033002）；土荆皮乙酸（大连美仑生物科技有限公司，批号J0826AS）；氧化苦参碱、欧前胡素、苦参碱、蛇床子 素、丁香酚（批号 Y30S6Y17043、D07S10E97290、T03F9F54046、T08M8B30733、H22A10Z86166，上海源叶生物科技有限公司）；乙酰基丁香酚、百部碱（南京金益柏生物科技有限公司，批号191103、190321）；苦参酮（成都格利普生物科技有限公司，批号190120）。

表1 处方分析筛选出的27 味药材

2 方法

2.1 药材提取 将药材粉碎后过2 号筛，精密称定10 g 于具塞锥形瓶中，加10 倍量75%乙醇，50 ℃水浴锅中浸泡12 h 后，50 ℃超声处理1 h，过滤后取滤液，于旋转蒸发仪挥干溶剂，50 ℃烘箱烘干48 h，得中药提取物，－20 ℃条件下保存。

2.2 体外抗红色毛癣菌的药效研究 实验过程遵照美国临床实验室标准化协会标准，以最低抑制浓度（MIC）为评价指标，考察药物／化合物抗红色毛癣菌药效。

将冷冻保存的红色毛癣菌甘油管划线接种PDA 平板，置于35 ℃、相对湿度80%条件下培养6 d。用5 mL 0.9%NaCl 溶液覆盖平板，用涂布器轻轻刮平板表面，获得孢子悬液。稀释100 倍，使用显微镜及红细胞计数器进行计数。计数结果为47、57、44、54，则原液孢子为505 000／mL。将800 μL 菌液加至250 mL 测试培养基，获得接种液。

将待测化合物及氟康唑溶解于DMSO，配制成待测化合物51.2 mg／mL、氟康唑12.8 mg／mL。将氟康唑用DMSO稀释2 倍（即6.4 mg／mL），备用。待测化合物在96 孔板中进行梯度稀释，得到质量浓度51.2、25.6、12.8、6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0 mg／mL 的溶液。氟康唑在96 孔板中进行梯度稀释，得到质量浓度6.4、3.2、1.6、0.8、0.4、0.2、0.1、0.05、0.025、0.012 5、0.006 25、0 mg／mL 的溶液。从化合物母板中转移2 mL 化合物工作液，加于含培养基的96-U 孔板，获得化合物检测板。所有组别平行3 份。在化合物检测板中加入198 μL 各真菌接种液，获得MIC 检测板。将MIC 检测板置于35 ℃、相对湿度80% 条件下，静置培养4 d 后读取MIC 数值［6］。用油镜观察药材在MIC 浓度培养后的菌丝状态。

2.3 色谱条件 Agilent Poroshell 120 EC-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，2.7 μm）；流动相乙腈（A）-水（含0.1%甲酸）（B），丁香、蛇床子、百部、大黄、土荆皮按表2 进行梯度洗脱，苦参按表3 进行梯度洗脱；柱温30 ℃；体积流量0.3 mL／min；进样量1 μL。

表2 梯度洗脱程序

表3 梯度洗脱程序

2.4 质谱条件 毛细管电压5 500 V（正离子模式）、－4 500 V（负离子模式）；洗脱溶剂温度550 ℃；气帘气压力241.3 kPa；雾化器压力379.2 kPa。取“2.1” 项下制备供试品，用75%乙醇稀释100 倍，离心后取上清液进样测定。

2.5 药材成分数据库的建立与分析 利用TCMSP 数据库及文献数据建立中药的成分数据库。利用MassHunter 对药材的质谱图进行成分分析，与自建数据库中成分匹配，筛选出相对含量大于1%的成分，成分的二级质谱碎片与标准品质谱数据、Massbank 数据库进行比对。

3 结果

3.1 体外抗红色毛癣菌药效 苦参、土荆皮的抑菌效果最好，MIC 值为64 μg／mL；大黄、丁香、蛇床子、百部具有较好的抑菌效应，MIC 值为64 μg／mL，见表4。

表4 对红色毛癣菌最小抑菌浓度（MIC）

选取抗红色毛癣菌效果优良的6 味中药（苦参、土荆皮、大黄、丁香、蛇床子、百部），用油镜观察其在MIC 浓度培养后的菌丝状态（图1）。6 味中药提取物不同程度地展现出对红色毛癣菌细胞壁与细胞膜的破坏作用，菌丝细胞壁均有融合的趋势［6］。

图1 红色毛癣菌油镜图

3.2 成分分析 各中药提取物与相应混合对照品的提取离子色谱图见图2。以MassHunter 对离子色谱图进行分析，根据加合离子［M＋H］＋信息判断并得到一级质谱精确相对分子质量，通过MassHunter 软件数据库拟合化合物分子式，将结果与文献及数据库进行比对，对各色谱峰进行初步推测。筛选信噪比较好的二级质谱图以获取色谱峰的二级质谱信息，并获得化合物相应的碎片离子，根据离子的裂解情况及文献数据比对并推测化学成分。将相对含量较高成分与标准品的二级谱图进行比对，对成分进行确认，见表5。

表5 药材成分分析

图2 离子色谱图

3.3 抗红色毛癣菌作用机制 土荆皮乙酸、欧前胡素、蛇床子素、苦参酮均显示较强抗红色毛癣菌的抑菌作用，MIC值为16 μg／mL，其土荆皮丙酸、苦参碱、氧化苦参碱、百部碱等成分无抗红色毛癣菌作用，结果见表6。

表6 对红色毛癣菌最小抑菌浓度（MIC）

4 讨论

筛选出的6 味药材对红色毛癣菌菌丝的细胞壁均有不同程度的融合趋势。破坏细胞壁及细胞膜的完整性正是大部分天然提取物对真菌作用的主要机理［7-11］，抑菌效果最好的是苦参和土荆皮。中医的辨证论治认为本病多因湿热下注或血虚风燥引起，亦可因接触患者的用具沾染虫毒导致［12］。香豆素类成分欧前胡素、蛇床子素和土荆皮乙酸对红色毛癣菌有较好的抑菌效果，丁香酚、乙酰基丁香酚、苦参酮有一定的抑菌效果［13-15］。苦参碱、氧化苦参碱、百部碱无抗红色毛癣菌效应，这可能与菌种差异有关［16-17］。一种药物对不同菌株的作用不同，可能与其作用靶点不同有关［18］。

以红色毛癣菌为代表的足癣真菌多适宜在碱性环境下生长，故将患处浸泡于酸性环境是临床上治疗足癣的常用方法［19-20］。对红色毛癣菌有较好抑制作用的6 种成分均显示不同程度的酸性，如乙酰基丁香酚、土荆皮乙酸因具羧基而显酸性，丁香酚、苦参酮因具酚羟基而显示出一定的酸性，香豆素类化合物则多呈中性或弱酸性；相反，生物碱类成分却显示较弱抗红色毛癣菌效应，提示中药成分对真菌生长环境酸碱性的改变可能是发挥其抗菌抑菌作用的重要原因［21］。同时，正常人表面皮肤呈弱酸性，保持正常的酸性状态也是保护皮肤抗细菌和真菌侵害的重要条件［22］。

本研究从筛选抗菌药物到药效物质基础，一定程度阐释中药抗菌的机制，为针对红色毛癣菌引起的皮肤疾病的药物研制提供科学依据。