两种滇西北黄芪属植物醇提物改善HepG2 细胞胰岛素抵抗的作用研究

刘汉福胡 晶谢琴琴姜 北肖朝江王金达沈 磊*

［1.云南省滇西抗病原植物资源筛选研究重点实验室（培育）， 云南 大理 671000； 2.大理大学药学院，云南 大理 671000］

近年来，黄芪已被证明具有一定治疗糖尿病的作用，如黄芪降糖颗粒能降低2 型糖尿病小鼠的空腹血糖［1］；黄芪消渴方联合胰岛素治疗气阴两虚型2 型糖尿病时，疗效和安全性均优于单用胰岛素［2］；黄芪桂枝五物汤能改善气虚血瘀型糖尿病患者的周围神经病变［3］；黄芪乌梅配方可降低自发性糖尿病大鼠的血糖和游离脂肪酸［4］。除此之外，黄芪多糖、黄芪甲苷和黄芪黄酮也有控制血糖和治疗糖尿病并发症的疗效［5-7］。

药用正品黄芪为蒙古黄芪Astragalus membranaceusvar.mongholicus或膜荚黄芪Astragalus membranaceus的根，生长于高纬度地区。云南没有正品黄芪分布，却是黄芪属植物在我国的分布中心之一，且绝大部分生长于滇西北的高海拔地区，其独特的药用价值亟待开发。本课题组前期对不同种黄芪属植物的化学成分进行了研究［8-10］，发现同为黄芪亚属，梭果黄芪Astragalus ernestiiComber 主要成分与正品黄芪类似，多为环阿屯烷型三萜皂苷类和黄酮苷类化合物，而云南黄芪Astragalus yunnanensisFranch 中大多数为甾体类成分。因此，本研究聚焦胰岛素抵抗这一2 型糖尿病的关键特征来探讨梭果黄芪和云南黄芪是否具有与正品黄芪类似的治疗糖尿病的潜力，为了解滇西北黄芪属植物的药用价值提供依据。

1 材料

1.1 细胞 人肝癌HepG2 细胞来源于ATCC 细胞库，购自武汉普诺赛生命科技有限公司，于常规高糖DMEM 培养基中培养、传代，取第3～10 代细胞用于实验。

1.2 试剂与药物 正品黄芪的原产地为甘肃，购自云南省大理市下关万花路健之佳药店，批号20 180102；梭果黄芪和云南黄芪全株采于云南省香格里拉，经大理大学张德全教授鉴定为梭果黄芪Astragalus ernestiiComber 和云南黄芪Astragalus yunnanensisFranch。乙腈（批号211921）购自西格玛奥德里奇（上海）贸易有限公司；纯净水（批号20211103）购自杭州娃哈哈集团有限公司；盐酸吡格列酮（批号P7701）、牛血清白蛋白（BSA，批号1016J051）、牛胰岛素（批号121R021）、胰蛋白酶（批号20190819）、己糖激酶测定试剂盒（批号20201211）、蛋白浓度测定试剂盒（BCA 法，批号20210513），CCK-8 试剂盒（批号508E013）均购自北京索莱宝科技有限公司；DMEM 高糖培养基（批号2072064）、胎牛血清（批号2168090RP）均购自美国Gibco 公司；DMEM 无糖无酚红培养基（批号PM150278）购自武汉普诺赛生命科技有限公司；葡萄糖（批号SLBZ6903）购自美国Sigma 公司；葡萄糖检测试剂盒（GOD-POD 法，批号0713A19）购自北京雷根生物技术有限公司；RNA 提取试剂盒（批号7E413L0）、反转录试剂盒（批号7E591D1）、Real-time PCR 试剂盒（批号7E561F1）购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司；葡萄糖转运蛋白1（GLUT1）、葡萄糖转运蛋白4（GLUT4）、β-肌动蛋白（β-actin）引物序列由生工生物工程（上海）股份有限公司设计合成。

1.3 仪器 生物安全柜（BSC-1000ⅡA2 型），苏州安泰空气技术有限公司；CO2培养箱（NU-5510／E 型），美国Nuaire 公司；高速冷冻离心机（HC-3018R 型），安徽中科中佳科学仪器有限公司；相差显微镜（CKX41 型），日本Olympus 公司；多功能酶标仪（Varisoskan LUX 型），美国Thermo 公司；PCR 仪（785BR15145 型），美国Bio-Rad 公司；核酸蛋白测定仪（N60 型），德国Implen 公司；高效液相色谱仪（1260 型），美国安捷伦公司；电子天平（EL204 型），赛多利斯科学仪器（北京）有限公司。

2 方法

2.1 黄芪提取物制备 将3 种黄芪的干燥根（正品黄芩37.7 g、梭果黄芩16.2 g、云南黄芩16.6 g）分别粉碎成粗粉，经乙醇热回流提取3 次（75%乙醇1 h、95%乙醇2 h、95%乙醇2 h），减压浓缩后得浸膏，再经冷冻干燥后制成冻干粉，得率分别为正品黄芪41.5%、梭果黄芪13.2%、云南黄芪13.9%。细胞实验时，用DMSO 将提取物配制成生药量200 mg／mL 的母液，涡旋混匀，超声溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤后备用，再用培养基稀释母液至相应质量浓度用于实验。

2.2 黄芪提取物对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响 取对数生长期的HepG2 细胞，以1×105／mL 的密度接种于96 孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁长至融合度80%后，弃培养基，PBS 洗1 次，加入含生药10、1、0.1、0.01、0.001 g／L 的3 种黄芪的无酚红高糖DMEM 培养基（含10%FBS，25 mmol／L 葡萄糖）处理细胞24 h，另设不加药物的正常组（高糖DMEM 孵育细胞）和空白组（仅有培养基，无细胞）。取3 μL 上清液用葡萄糖氧化酶法（GOD-POD 法）检测葡萄糖含量，再将培养基换为含CCK-8 试剂的培养基于37 ℃孵育1 h 后测定450 nm 波长处的吸光度（A）值。细胞相对活力＝A给药孔／A正常对照孔×100%；葡萄糖消耗量＝空白对照孔葡萄糖含量－测试孔葡萄糖含量；标准化葡萄糖消耗量＝葡萄糖消耗量／细胞相对活力。

2.3 HepG2 细胞胰岛素抵抗模型的建立 按“2.2” 项下方法将细胞接种于96 孔板，贴壁培养至融合度80%后，吸弃培养基，PBS 洗1 次，加入含1×10－5～1×10-8mol／L 胰岛素的无酚红高糖DMEM，另设正常组（加入不含胰岛素的无酚红高糖DMEM）和空白组（仅有培养基，无细胞），培养24、36、48 h 后，按“2.2” 项下方法检测细胞相对活力和标准化葡萄糖消耗量。

2.4 黄芪提取物对HepG2 细胞胰岛素抵抗的影响

2.4.1 细胞相对活力和标准化葡萄糖含量测定 经胰岛素抵抗模型条件的摸索，确定采用含1×10-6mol／L 胰岛素的高糖DMEM 孵育细胞36 h 建立胰岛素抵抗细胞模型。细胞接种于96 孔板并生长至对数生长期后，分成12 组，分别为正常组、模型组、阳性药吡格列酮组及正品黄芪、梭果黄芪、云南黄芪各3 个剂量组（1、0.1、0.01 g／L），除正常组（加入不含胰岛素的高糖DMEM）外，各组均加入含1×10-6mol／L 胰岛素的无酚红高糖DMEM 孵育36 h，弃培养基后PBS 洗1 次，加入含不同剂量黄芪的无血清无酚红高糖DMEM（含0.2% BSA），正常组和模型组加入不含药的培养基，吡格列酮组加入含0.003 92 g／L（1×10-6mol／L）吡格列酮的培养基，作用24 h 后测定细胞相对活力和标准化葡萄糖消耗量。

2.4.2 己糖激酶活性检测 将细胞以5×105／mL 的密度接种于12 孔板中，每孔2 mL，按“2.4.1” 项下方法分组（其中3 种黄芪仅设1、0.1 g／L 2 个剂量）、造模和药物处理，24 h 后每孔收集5×105个细胞，加入提取液裂解细胞，4 ℃、8 000×g离心10 min，取30 μL 上清液与己糖激酶试剂盒中的反应试剂进行反应，于20、320 s 时检测340 nm波长处的A值，计算己糖激酶活性，同时采用BCA 法测定蛋白浓度。

2.4.3GLUT1、GLUT4 mRNA 表达检测 按“2.4.2” 项下方法接种细胞、分组、造模和药物处理，提取各孔细胞的总RNA，并测定RNA 浓度，按照试剂盒说明书方法将RNA 逆转录为cDNA。加入特异性引物后用实时荧光定量PCR 法扩增目的片段并检测基因表达，每孔重复3 次，计算平均值作为每个样品的CT值，每组设3 个复孔。以βactin为内参，用2－ΔΔCT法分析GLUT1、GLUT4 mRNA 相对表达。GLUT1 正向序列CTGTCGTGTCGCTGTTTGTG，反向序列GGCCACAAAGCCAAAGATGG；GLUT4 正向序列CTT CTTTGAGATTGGCCCTGG，反向序列AGGTGAAGATGAAG AAGCCAAGC；β-actin正向序列GAGACCTTCAACACCCC AGCC，反向序列AATGTCACGCACGATTTCCC。

2.5 HPLC 分析 取3 种黄芪的冻干粉，加色谱纯甲醇溶解至13.3 mg／mL，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后备用。色谱条件为Agilent SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流动相乙腈（A）-水（B），梯度洗脱（0～5 min，5%～10% A；5～20 min，10%～30% A；20～30 min，30%～40%A；30～43 min，40% A；43～60 min，40%～100% A；60～65 min，100% A）；体积流量1 mL／min；柱温35 ℃；检测波长210 nm；进样量30 μL。

2.6 统计学分析 通过SPSS 26.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，多组间均值比较采用单因素方差分析，两组间比较采用LSD 法。P＜0.05 表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 不同黄芪属植物醇提物对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响 与正常组比较，10 g／L 正品黄芪、梭果黄芪均能抑制细胞生长（P＜0.05，P＜0.01），10 g／L 云南黄芪也能抑制细胞生长，但差异无统计学意义（P＞0.05）。与正常组比较，10 g／L 正品黄芪、梭果黄芪能降低标准化葡萄糖消耗量（P＜0.05），这可能是由于抑制了细胞生长所致，其余剂量黄芪醇提物对细胞的葡萄糖消耗均无明显作用（P＞0.05），见表1。因此，采用1、0.1、0.01 g／L 的剂量进行后续实验。

表1 不同黄芪属植物醇提物对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

表1 不同黄芪属植物醇提物对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.2 胰岛素抵抗模型的建立 与对照组（0 mol／L）比较，随着胰岛素孵育时间增加，较低浓度的胰岛素能促进细胞增殖，其中1×10－8mol／L 胰岛素孵育36 h 或48 h，1×10－6mol／L 胰岛素孵育48 h 均能增加细胞相对活力（P＜0.01）。4 个浓度胰岛素孵育不同时间均能一定程度地减少标准化葡萄糖消耗量（P＜0.05，P＜0.01），其中以1×10－6mol／L胰岛素建立的胰岛素抵抗模型最稳定，且孵育36 h 后与对照组比较，葡萄糖消耗量差值最大（P＜0.01），见表2。因此，选择1×10－6mol／L 胰岛素孵育36 h 来诱导HepG2 细胞胰岛素抵抗模型。

表2 不同浓度胰岛素作用不同时间对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

表2 不同浓度胰岛素作用不同时间对HepG2 细胞相对活力和葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

注：与同时间点对照组（0 mol／L）比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响 如表3 所示，与正常组比较，模型组细胞相对活力升高（P＜0.01），而标准化葡萄糖消耗量降低（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药吡格列酮组及1、0.1 g／L 正品黄芪组、1 g／L 梭果黄芪组、0.1 g／L 云南黄芪组均能增加标准化葡萄糖消耗量（P＜0.05，P＜0.01），说明以上药物可以改善HepG2 细胞的胰岛素抵抗。当剂量为1 g／L 时，增加标准化葡萄糖消耗量的能力为正品黄芪＞梭果黄芪＞云南黄芪；而当剂量为0.1 g／L时，云南黄芪＞正品黄芪＞梭果黄芪。此外，梭果黄芪能在模型的基础上进一步促进细胞增殖。

表3 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

表3 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞葡萄糖消耗量的影响（±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞内已糖激酶活性的影响 与正常组比较，胰岛素抵抗模型组细胞内己糖激酶活性下降（P＜0.05）；与模型组比较，吡格列酮组、1 g／L 正品黄芪组和1 g／L 梭果黄芪组均能增加己糖激酶活性（P＜0.05，P＜0.01），其他剂量的3 种黄芪也有升高己糖激酶活性的作用，但差异无统计学意义（P＞0.05）。当剂量为1 g／L 时，增加己糖激酶活性的能力为正品黄芪＞梭果黄芪＞云南黄芪，见表4。

表4 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞内己糖激酶活性的影响（±s， n＝8）

表4 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞内己糖激酶活性的影响（±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃ P ＜0.05；与模型组比较，* P ＜0.05，**P＜0.01。

3.5 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞GLUT1、GLUT4 mRNA 表达的影响 如表5 所示，胰岛素抵抗后，模型组GLUT1、GLUT4 mRNA 表达均较正常组下降（P＜0.01）；与模型组比较，吡格列酮组、正品黄芪组、梭果黄芪组和云南黄芪组均可增加GLUT1、GLUT4 mRNA 表达（P＜0.05，P＜0.01）。其中，梭果黄芪的作用最强；正品黄芪对GLUT1 mRNA 表达的作用稍强于云南黄芪，而对GLUT4 mRNA 表达的作用与云南黄芪相当。

表5 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞GLUT1、 GLUT4 mRNA 表达的影响（±s， n＝3）

表5 不同黄芪属植物醇提物对胰岛素抵抗HepG2 细胞GLUT1、 GLUT4 mRNA 表达的影响（±s， n＝3）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.6 HPLC 化学成分分析 如图1 所示，3 种黄芪的出峰情况有异同。在10～24 min 的大极性区间，3 种黄芪呈现的色谱峰类似而峰高（含量）有差异；在30～50 min 区间，3种黄芪样品的色谱峰有差异性，表现为正品黄芪和梭果黄芪在30～35 min 有吸收峰，而云南黄芪在47 min 有吸收峰；当保留时间为58、60 min 时，3 种黄芪均有吸收峰，但是含量不同。

图1 不同黄芪属植物醇提物HPLC 色谱图

4 讨论

胰岛素抵抗是指外周组织对胰岛素利用不足［11］，对血糖的消耗量降低，是2 型糖尿病的显著特征。过量胰岛素诱导糖原合成的能力下降是导致胰岛素抵抗的重要原因。葡糖糖转运体、激酶磷酸化和糖原的储存是调节胰岛素介导糖原合成代谢的3 个主要控速步骤，可作为调控胰岛素抵抗的主要靶标［12］。本研究表明，实验所用剂量范围内的3 种黄芪不影响正常的葡萄糖消耗量，却能增加高糖高胰岛素诱导的葡萄糖消耗量，说明这些黄芪对胰岛素抵抗均有一定的改善作用。同时，正品黄芪和梭果黄芪恢复己糖激酶活性和改善葡萄糖转运体活性的能力较云南黄芪强。

在胰岛素抵抗中，胰岛素促进糖原合成和葡萄糖转运的能力均下降。葡萄糖转运蛋白（GLUT）介导了葡萄糖的跨膜转运［13］，GLUT1 负责基础条件下大部分组织中的葡萄糖摄取［14］；GLUT4 在胰岛素敏感组织中高表达［15］，胰岛素刺激后，GLUT4 转运葡萄糖的活性增强［16］。本研究发现，胰岛素抵抗发生后，2 种GLUT 的活性均下降；正品黄芪和梭果黄芪均能提高2 种GLUT 的活性，而云南黄芪主要增加GLUT4 的活性，说明正品黄芪和梭果黄芪能明显改善胰岛素抵抗发生后大部分组织的基础血糖转运和胰岛素敏感组织的血糖吸收，而云南黄芪主要针对胰岛素敏感组织的葡萄糖转运。葡萄糖转运入细胞后在己糖激酶的作用下生成6-磷酸-葡萄糖（G6P），促进细胞内糖原合成或葡萄糖分解，而胰岛素通过增强己糖激酶活性来降低血糖［17］。本研究发现，产生胰岛素抵抗的HepG2 细胞内己糖激酶活性降低，使得胰岛素作用减弱；正品黄芪和梭果黄芪能提高己糖激酶活性来改善胰岛素抵抗，但云南黄芪无此作用。

3 种黄芪对胰岛素抵抗作用靶点的区别可能与其所含化学成分种类和含量的差别有关。根据报道可知，正品黄芪中主要含有环阿屯烷型三萜皂苷类成分（如黄芪皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）、黄酮苷类成分（如黄酮、异黄酮）等［18-20］。课题组前期研究表明，梭果黄芪含有与正品黄芪类似的黄酮苷类成分（如毛蕊异黄酮-7-O-β-D-葡萄糖苷）和环阿屯烷型三萜皂苷类成分（如梭果黄芪苷A、B、C）等［8，10，21］，而云南黄芪中的成分大多为甾体类（如蒲公英甾醇、β-谷甾醇等甾体等）［9］。本研究通过HPLC 分析发现，3 种黄芪的化学成分既有类似也有区别，尤其是在保留时间30～50 min区间，正品黄芪和梭果黄芪出峰多，而云南黄芪出峰少。由于黄酮类成分含吸收强的共轭键，云南黄芪含的黄酮类成分可能少于另外2 种黄芪。

综上所述，云南黄芪改善胰岛素抵抗的作用要弱于正品黄芪和梭果黄芪，其中梭果黄芪表现出更好的治疗糖尿病潜力。