基于PCSK9-LDLR 信号通路探讨三七破壁粉对高脂血症大鼠的降脂作用

翁路安，苏 洁，王 婷，陈素红，高鸿斐，吕圭源*

（1.浙江中医药大学，浙江 杭州 310053； 2.浙江工业大学，浙江 杭州 310014； 3.浙江英特医药药材有限公司，浙江 杭州 310000）

高脂血症是临床上常见的脂质代谢紊乱性疾病，根据临床表现，中医常将其归于“痰瘀” 范畴，《医学心悟》提到：“凡人嗜食肥甘，或醇酒奶酪，则湿从内受”。可见过食肥甘厚味醇酒之品，会令湿热内生，损伤脾胃运化，清者不升，浊者不降，导致“痰浊” 等病理产物瘀留于内。前期研究表明，高脂饮食加酒精喂养，能造成大鼠脂质代谢紊乱，同时引起血液黏度的升高［1］。

《血证论》 提到：“须知痰水之壅，由瘀血使然，但去瘀血，则痰水自行”，可见活血化瘀法对于痰浊有治疗作用。三七具有活血化瘀、补血、止血等作用，临床上常用于治疗高脂血症等心血管疾病［2-3］。研究报道三七具有改善脂质代谢及血液流变学等作用［4-5］。三七破壁粉是将三七经超微粉碎技术加工为粒径小于75 μm 的粉体制剂，传统饮片经过超微粉碎后，其药物表面积增大，有效成分的溶出也随之增加，从而提高了生物利用度。有研究发现三七经超微粉碎后其3 种皂苷类成分的溶出速率均明显提高［6］，其活血化瘀等药理作用也随之增强［7］，推测三七破壁粉改善血脂水平的作用可能也随之增强。目前，关于三七调节血脂的作用研究主要集中在其有效成分或不同的提取部位，尚未见三七破壁粉调节血脂作用的研究报道。故本实验通过高脂复合饮酒建立高脂血症大鼠模型，检测血脂、血流变、肝脏病变等指标，以及肝组织中PCSK9、LDLR 的mRNA 和蛋白表达，研究三七破壁粉对高脂血症的药效作用及相关降脂机制，以期为中药超微粉入药提供科学依据。

1 材料

1.1 实验动物 40 只SPF 级雄性SD 大鼠，体质量300～400 g，购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，实验动物生产许可证号SCXK（沪）2017-0005。饲养环境温度20～25 ℃，相对湿度40%～70%，光照12 h 更替，循环通风换气。

1.2 试剂与药物 三七破壁粉（文山市苗乡三七实业有限公司，批号BSQ-SQ-180110）。高脂高胆固醇饲料（南通特洛菲饲料科技有限公司，批号20190829）；红星二锅头酒（北京红星股份有限公司，批号20190604）；总胆固醇（TC，批号190115101）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-c，批号190508201）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-c，批号190510211）、天门冬氨酸氨基转移酶（AST，批号190612101）、丙氨酸氨基转移酶（ALT，批号190619101），均购自宁波美康生物科技有限公司；纤维蛋白原（Fb）试剂盒（货号MM-61544R1）、肿瘤坏死因子α（TNF-α）试剂盒（货号MM-0180R1）、大鼠白介素6（IL-6）试剂盒（货号MM-0190R1），均购自江苏酶免实业有限公司；低密度脂蛋白受体（LDLR）抗体（武汉爱博泰克生物科技有限公司，货号A14996）；前蛋白转化酶枯草杆菌蛋白酶／kexin9 型（PCSK9）抗体（货号WL03068）、羊抗兔IgGHRP（货号 WLA023）、内参抗体 β-actin（货号WL01845），均购自沈阳万类生物科技有限公司；TRIpure（货号RP1001）、Super M-MLV 反转录酶（货号PR6502）、RNase inhibitor（货 号 RP5602）、2 × Power Taq PCR MasterMix（货号PR1702），均购自美国BioTek 公司；SYBR Green（北京索莱宝科技有限公司，货号SY1020）；引物由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。

1.3 仪器 FA2204B 型电子天平（上海精科天美科学仪器有限公司）；FASCO-3010D 型全自动血流变快测仪（重庆维多科技有限公司）；D-37520 型微量离心机、NANO 2000型紫外分光光度计（美国Thermo 公司）；TBA-40FR 型全自动生化分析仪（日本东芝医疗系统株式会社）；Powerwave340 型酶标仪（美国BioTek 公司）；DYCZ-24DN型双垂直蛋白电泳仪、WD-9413B 型凝胶成像系统（北京六一生物科技有限公司）；Exicycler 96 型荧光定量PCR 仪（韩国Bioneer 公司）。

2 方法

2.1 模型建立与分组给药 大鼠随机分成正常组、模型组和三七破壁粉低、中、高剂量（12.5、25、50 mg／kg）组，每组8 只。除正常组给予普通饲料和饮水喂养，其余各组采用高脂复合饮酒喂养。造模4 周后，各给药组分别灌胃给予相应药物，正常组和模型组灌胃给予蒸馏水，灌胃容量为10 mL／kg，每天1 次，连续16 周。

2.2 血脂及肝功能指标检测 给药8、14 周，大鼠禁食不禁水12 h，眼眶取血，37 ℃水浴静置1 h，3 500 r／min 离心10 min，取上层血清，采用全自动血生化仪检测血清中TC、HDL-c、LDL-c、AST、ALT 水平。

2.3 血液流变学相关指标检测 给药15 周，禁食不禁水12 h，眼眶取血置于肝素钠抗凝管中，采用全自动血流变快测仪检测全血黏度和血浆黏度。待测完全血黏度后，3 500 r／min 离心10 min，分离上层血浆，按试剂盒说明书检测血浆中Fb 水平。

2.4 血清IL-6、TNF-α 水平检测 给药15 周，禁食不禁水12 h，眼眶取血，37 ℃水浴静置1 h，3 500 r／min 离心10 min，取上层血清，按试剂盒说明书检测大鼠血清IL-6、TNF-α 水平。

2.5 肝脏系数及肝组织病理变化 末次给药后，大鼠禁食不禁水12 h，称定体质量，解剖取肝脏，生理盐水清洗干净，称量脏器湿重，计算肝脏系数。取肝脏相同部位，经10%福尔马林固定48 h，乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋，制备4 μm 石蜡切片，分别进行HE 和Masson 染色，中性树脂封片干燥后，生物显微镜下观察肝组织形态学改变和胶原沉积情况。

2.6 RT-qPCR 法检测肝组织LDLR、PCSK9 mRNA 表达参照TRIpure 试剂盒说明书提取大鼠肝组织总RNA，使用紫外分光光度计测量样本RNA 浓度，经逆转录获得cDNA，然后进行实时荧光PCR 扩增（94 ℃预变性5 min，94 ℃变性10 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，40 个循环）。以β-actin为内参，用2－ΔΔCT法计算LDLR、PCSK9 mRNA 相对表达量，引物序列见表1。

表1 引物序列

2.7 Western blot 法检测肝组织LDLR、PCSK9 蛋白表达取各组肝组织样本，解冻后加入RIPA 裂解液，冰上匀浆裂解30 min，4 ℃、12 000 r／min 离心10 min，收集上清液（总蛋白溶液），BCA 法测蛋白浓度。SDS-PAGE 电泳分离蛋白，转膜，TBST 漂洗，5% 脱脂奶粉封闭1 h，加一抗4 ℃孵育过夜，TBST 洗涤3 次，加二抗室温孵育1 h，TBST 洗涤3 次，滴加ECL 工作液1～2 min 后去尽残液，凝胶成像系统采集图像，分析数据。

2.8 统计学分析 采用SPSS 19.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 三七破壁粉对高脂血症大鼠血脂水平的影响 给药8周时，与正常组比较，模型组大鼠血清TC、LDL-c 水平升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠血清TC、LDL-c 水平均降低（P＜0.01），见表2。给药14 周时，与正常组比较，模型组大鼠血清TC、LDL-c 水平均升高（P＜0.01），HDL-c 水平降低（P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠血清TC、LDL-c 水平均降低（P＜0.01），三七破壁粉高剂量组血清HDL-c 水平升高（P＜0.01），见表3。结果表明，三七破壁粉可以有效调节高脂血症大鼠血清TC、LDL-c 水平。

表2 三七破壁粉给药8 周对高脂血症大鼠血脂水平的影响（mmol／L，±s， n＝8）

表2 三七破壁粉给药8 周对高脂血症大鼠血脂水平的影响（mmol／L，±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

表3 三七破壁粉给药14 周对高脂血症大鼠血脂水平的影响（mmol／L，±s， n＝8）

表3 三七破壁粉给药14 周对高脂血症大鼠血脂水平的影响（mmol／L，±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，**P＜0.01。

3.2 三七破壁粉对高脂血症大鼠血清肝功能的影响 给药8 周时，与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组血清ALT 水平降低（P＜0.01），AST 水平有所降低但无显著差异（P＞0.05）。给药14 周时，与正常组比较，模型组大鼠血清ALT、AST 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠血清ALT水平降低（P＜0.01），高剂量组血清AST 水平（P＜0.05），见表4。结果表明，三七破壁粉可以改善高脂血症大鼠血清肝功能水平，尤其对ALT 水平的改善效果较显著。

表4 三七破壁粉对高脂血症大鼠血清ALT、AST 水平的影响（U／L，±s， n＝8）

表4 三七破壁粉对高脂血症大鼠血清ALT、AST 水平的影响（U／L，±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.3 三七破壁粉对高脂血症大鼠血液流变学相关指标的影响 与正常组比较，模型组大鼠全血黏度无显著差异（P＞0.05），血浆黏度升高（P＜0.05）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠全血黏度和血浆黏度均降低（P＜0.05，P＜0.01），见表5。结果表明，三七破壁粉可以改善高脂血症大鼠的血液黏度。

表5 三七破壁粉对高脂血症大鼠血液流变学相关指标的影响（±s， n＝7～8）

表5 三七破壁粉对高脂血症大鼠血液流变学相关指标的影响（±s， n＝7～8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.4 三七破壁粉对高脂血症大鼠血浆Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影响 与正常组比较，模型组大鼠IL-6、TNF-α、Fb 水平均升高（P＜0.05，P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉低剂量组TNF-α、IL-6、Fb 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），高剂量组TNF-α 水平降低（P＜0.01），见表6。结果表明，三七破壁粉可以改善高脂血症大鼠血清炎症因子及血浆纤维蛋白原水平。

表6 三七破壁粉对高脂血症大鼠血浆Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影响（±s， n＝8）

表6 三七破壁粉对高脂血症大鼠血浆Fb 及血清IL-6、TNF-α 水平的影响（±s， n＝8）

注：与正常组比较，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3.5 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝脏病变的影响 与正常组比较，模型组大鼠体质量和肝脏质量升高（P＜0.01）；给药16 周后，与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠体质量和肝脏质量降低（P＜0.01），中、高剂量组肝脏指数降低（P＜0.05，P＜0.01），见表7。结果表明，三七破壁粉可以改善高脂血症大鼠的肝脏指数。

表7 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝脏病变的影响（±s， n＝7～8）

表7 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝脏病变的影响（±s， n＝7～8）

注：与正常组比较，＃＃P＜0.01；与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

HE 染色结果显示，正常组大鼠肝细胞胞质丰富、大小均匀，肝索排列整齐，肝窦清晰可见，肝细胞脂肪变性和炎症浸润少见，肝细胞在静脉周围呈放射状整齐排列；模型组大鼠肝索排列紊乱，肝细胞肿胀，细胞间隙增大，出现大小不一的脂肪空泡；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠肝细胞脂肪病变均有不同程度减轻，见图1。

图1 各组大鼠肝组织HE 染色图（×200）

Masson 染色结果显示，正常组大鼠肝脏血管及周围有轻度的胶原沉积被染成蓝色；模型组大鼠肝脏中有较多的胶原沉积，在血管周围及细胞间质可明显观察到纤维增加；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组肝细胞之间胶原纤维相对减少，见图2。

图2 各组大鼠肝组织Masson 染色图（×100）

3.6 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝组织PCSK9、LDLRmRNA 表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织LDLRmRNA 表达降低（P＜0.01），PCSK9 mRNA 表达升高（P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠肝组织LDLRmRNA 表达升高（P＜0.01），PCSK9 mRNA 表达降低（P＜0.01），见图3。

图3 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝组织PCSK9、 LDLR mRNA 表达的影响（±s， n＝3）

3.7 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝组织PCSK9、LDLR 蛋白表达的影响 与正常组比较，模型组大鼠肝组织PCSK9蛋白表达升高（P＜0.01），LDLR 蛋白表达降低（P＜0.01）；与模型组比较，三七破壁粉各剂量组大鼠肝组织PCSK9 蛋白表达降低（P＜0.01），LDLR 蛋白表达升高（P＜0.01），见图4。

图4 三七破壁粉对高脂血症大鼠肝组织PCSK9、LDLR 蛋白表达的影响（±s， n＝3）

4 讨论

《临证指南》 指出“血病五脏、六腑皆有，三七治一切血症”。三七为活血化瘀的代表药，广泛应用于血液系统疾病等方面，可以降低高脂血症患者血脂水平、血液黏度［8］，具有改善脂质代谢及血液流变学等药理作用。研究发现，中药经超微粉碎后其有效成分在体内的吸收速率也显著提高［9-10］。三七总皂苷是三七的主要有效成分，具有调血脂、抗血栓和降低血小板活性等作用［11］。有研究发现三七总皂苷在消化道内与脂类结合形成不易吸收的物质，防止脂质在血管内沉积从而保护内膜，防止动脉粥样硬化［12-13］。有效成分溶出的增加，有利于增强相应的药理作用，故本实验通过建立高脂血症模型大鼠，研究三七破壁粉的降脂作用。

肝脏在血脂代谢中发挥重要的作用，同时也是血脂代谢紊乱直接受影响的脏器［14］。高脂复合饮酒造模后，大鼠肝脏指数升高，且肝脏呈肉眼可见的脂肪性病变。研究发现，高脂血症能引起肝组织脂肪空泡和肝脏脂质蓄积，同时肝小叶、细胞结构出现不同程度损伤［15］。病理结果显示，模型组大鼠肝细胞出现弥漫性脂肪病变，表现为大量肝细胞的气球样病变和小泡脂滴，并伴有较多的灶性纤维化。肝脏损伤会影响肝功能水平并引起炎症的发生，AST和ALT 主要分布在肝组织细胞中，其水平与肝细胞损伤程度呈正相关［16］，肝细胞损伤后血清中AST、ALT 水平升高。TNF-α 能在多方面影响脂质代谢，抑制TNF-α 水平可减轻酒精引起的脂肪变性，酒精诱导的其他细胞因子（如IL-6等）也可能影响脂质代谢水平［17］。实验结果显示，高糖高脂复合饮酒喂养可使大鼠血清AST、ALT、TNF-α 和IL-6 水平升高，三七破壁粉可以降低大鼠血清AST、ALT、TNF-α和IL-6 水平，进而减轻肝损伤程度，表明三七破壁粉可以改善高脂复合饮酒造成的肝损伤，对肝脏有保护作用。

研究发现PCSK9-LDLR 信号通路与血脂水平关系密切［18-19］，LDLR 在胆固醇代谢中发挥重要作用，其功能主要是通过内吞LDL 等脂蛋白，将LDL-c 等摄取入细胞进行代谢［20］。PCSK9 的主要生理功能之一是介导LDLR 的降解，控制LDL-c 颗粒在血液中循环的水平。当PCSK9 与LDLR 的表皮生长因子A 结构域结合时，可刺激LDLR 的降解。LDLR 表达的降低会导致LDL-c 代谢减弱，这可能会使TC 和LDL-c 水平升高［21-22］。本研究结果显示，三七破壁粉可能通过降低PCSK9 蛋白和mRNA 的表达，减少对LDLR的降解；升高LDLR 表达，促进肝脏对LDL-c 的摄取，使血脂维持在正常的水平。

综上所述，三七破壁粉可以改善高脂复合饮酒诱发的高脂血症大鼠血脂代谢异常，其机制可能是通过调控PCSK9-LDLR 信号通路减轻脂质代谢紊乱。