4 种提取方法对清咽润喉复方有效成分含量及抗炎镇痛作用的影响

韩江云，王春龙，李建平刘明华，陈斯玮，张 丹*

（1.西南医科大学附属中医医院药剂科，四川 泸州 646000； 2.西南医科大学药学院，四川 泸州 646000）

清咽润喉复方由青龙白虎汤加荷叶而来。青龙白虎汤，出自清代著名医家《王氏医案》 卷二［1］，由鲜青果、鲜莱菔组成，具有清热泻火、解毒利咽、生津止渴的功效，可用于治疗慢性咽炎［2］。青果，《本草纲目》 中记载“生津液，止烦渴，治咽喉痛”；现代研究表明，青果中黄酮和没食子酸均有抗炎、镇痛作用［3］。莱菔，即萝卜，为药食同源中药，可清热解毒、理气宽中；现代研究表明，萝卜具有清热生津、化痰止咳等作用［4］。荷叶，可除晕清痰、泄气、止呕；现代研究表明，荷叶中生物碱、黄酮类化合物具有抗菌、消炎等功效［5］。

复方现代研究中，醇和水为最常用提取溶剂，不同溶剂性质各异，故同一复方经不同溶剂提取，在成分种类、含量等方面也存在明显差异，将极大地影响复方药效发挥。因此，将有效成分和药效学相结合考察不同提取方法对复方药效的影响是一个更全面、更科学的考察方法［6］。本研究以清咽润喉复方为研究对象，通过对比其有效成分含量和抗炎镇痛效果探究最佳提取方法，以期为开发安全可靠、服用方便的清咽润喉相关产品奠定理论基础和实验支撑。

1 材料

1.1 试剂与药物 青果、荷叶购自四川天植中药股份有限公司，经西南医科大学生药学教研室庄元春副教授鉴定为正品，均符合2020 年版《中国药典》 一部各饮片项下要求；萝卜、鸡蛋清购自泸州市菜市场。没食子酸（批号MUST-17022801，纯度 99%）、荷叶碱（批号 MUST-17030204，纯度98.91%）对照品购自成都曼思特生物科技有限公司；滨蒿内酯对照品（批号Z05D7B26157，纯度98%）购自上海源叶生物科技有限公司；二甲苯（批号20150628）购自成都欣正通化工有限公司；地塞米松（批号110310）购自北京百灵威科技有限公司。甲醇、乙腈均为色谱纯，购自成都科隆化学品有限公司；冰乙酸为分析纯，购自天津申泰化学试剂有限公司。

1.2 仪器 LC-2030C 型高效液相色谱仪（日本岛津公司）；SQP 型电子分析天平（德国Sartorius 公司）；艾柯超纯水机（成都唐氏唐宁科技发展有限公司）。

1.3 动物 SPF 级昆明种小鼠、SPF 级SD 大鼠均由西南医科大学动物实验中心提供，实验动物生产许可证号SCXK（川）2018-0017，实验动物使用许可证号SCXK（川）2018-0063。本研究所有动物实验操作经西南医科大学实验动物伦理委员会批准。

2 方法与结果

2.1 提取与测定

2.1.1 提取方法

2.1.1.1 醇提法 将30 g 清咽润喉复方用10 倍量70%乙醇加热回流3 次，合并滤液，浓缩至适当体积，即得清咽润喉复方醇提液。

2.1.1.2 水提法 将30 g 清咽润喉复方用10 倍量水加热提取3 次，浓缩滤液至适当体积，即得清咽润喉复方水提液。

2.1.1.3 醇水双提法 先将适量青果、荷叶用10 倍量70%乙醇加热回流3 次，过滤，回收乙醇；另将滤渣与莱菔用10 倍量纯水加热提取3 次，过滤，合并乙醇提取物和水提取物，浓缩至当体积，即得清咽润喉复方醇水双提液。

2.1.1.4 挥发油双提法 称取青果、荷叶适量，打成粗粉，置圆底烧瓶中，加10 倍量水，浸泡30 min，按照2020年版《中国药典》 四部通则2204 挥发油测定法（甲法）提取，收集挥发油，滤渣用10 倍量70%乙醇提取3 次，过滤，回收乙醇；滤渣与莱菔加入10 倍量水，加热提取3次，过滤，合并乙醇提取物和水提取物，浓缩至适当体积，加入挥发油，即得清咽润喉复方挥发油双提液。

2.1.2 溶液制备

2.1.2.1 供试品溶液 分别量取10 mL “2.1.1” 项下4种提取液，挥干，10 mL 甲醇溶解，置于10 mL 棕色量瓶中，加甲醇定容，0.22 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。

2.1.2.2 对照品溶液 精密称取没食子酸、滨蒿内酯对照品适量，置于25 mL 棕色量瓶中，加入甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，制成质量浓度为0.060 9、0.008 2 mg／mL 的混合对照品溶液。精密称取荷叶碱对照品适量，置于25 mL 棕色量瓶内，加甲醇溶解，0.22 μm微孔滤膜过滤，取续滤液，制成质量浓度为0.010 4 mg／mL的对照品溶液。

2.1.3 色谱条件

2.1.3.1 没食子酸、滨蒿内酯 参考文献 ［7］报道，SHIMADZU Shim-pack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈（A）-0.5% 冰乙酸（B），梯度洗脱（0～5 min，2.5% A；5～21 min，2.5%～27% A；21～30 min，27%～35% A；30～32 min，35%～2.5% A；32～37 min，2.5%A）；体积流量1.0 mL／min；检测波长271 nm（没食子酸）、345 nm（滨蒿内酯）；柱温30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数以没食子酸计不低于3 000；以滨蒿内酯计不低于2 000。

2.1.3.2 荷叶碱 参考文献［8］报道，SHIMADZU Shimpack GIST C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相乙腈-0.1%三乙胺（60∶40）；体积流量0.8 mL／min；检测波长270 nm；柱温30 ℃；进样量10 μL。理论塔板数以荷叶碱计不低于2 000。

2.1.4 线性关系考察 取“2.1.2.2” 项下没食子酸、滨蒿内酯混合对照品溶液以及荷叶碱对照品溶液，分别在“2.1.3” 项色谱条件下进样2、4、6、8、10、12 μL，以进样量为横坐标（X），峰面积为纵坐标（Y）进行回归，结果见表1。

表1 各成分线性关系

2.1.5 精密度试验 取“2.1.2.2” 项下没食子酸、滨蒿内酯混合对照品溶液以及荷叶碱对照品溶液10 μL，分别在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定6 次，测得没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱峰面积RSD 分别为1.70%、2.00%、0.27%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 稳定性试验 取同一份“2.1.2.2” 项下没食子酸、滨蒿内酯混合对照品溶液以及荷叶碱对照品溶液，于0、2、4、6、12、24 h 在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱峰面积RSD 分别为1.66%、1.00%、1.32%，表明溶液在24 h 内稳定性良好。

2.1.7 重复性试验 取同一批“2.1.2.1” 项下供试品溶液6 份，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，测得没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱含量RSD 分别为1.00%、2.80%、1.10%，表明该方法重复性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取各成分含量已知供试品溶液，加入适量没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱的混合对照品溶液，按 “2.1.2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱加样回收率分别为104.21%、103.61%、102.53%，RSD 分别为2.38%、2.84%、2.38%。

2.1.9 干膏率测定 精密吸取“2.1.1” 项下所得提取液各25 mL，置干燥至恒重的蒸发皿中，水浴挥干后，在105 ℃烘箱中干燥3 h，取出置干燥器中，冷却至室温后，精密称定质量至恒重，计算干膏率，结果见表2。

表2 各成分含量测定结果

2.1.10 含量测定 精密吸取“2.1.1” 项下所得提取液适量，在“2.1.3” 项色谱条件下进样测定，计算4 种提取液中没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱含量。以青果中没食子酸含量、滨蒿内酯含量、荷叶中荷叶碱含量、干膏率作为考察指标，权重系数设置为0.3、0.2、0.2、0.3 进行综合评分。评分标准中，因没食子酸、滨蒿内酯和荷叶碱均为方中有效成分，具有抗炎镇痛效果，其中没食子酸在方中含量最高，而中药是多成分的综合作用，干膏率又为后续的成型工艺提供一定的依据，故综合评分中二者的权重系数分别设为0.3，滨蒿内酯和荷叶碱设为0.2，公式为综合评分＝（A×0.3＋B×0.2＋C×0.2＋D×0.3）×100（A＝没食子酸含量／没食子酸含量最大值，B＝滨蒿内酯含量／滨蒿内酯含量最大值，C＝荷叶碱含量／荷叶碱含量最大值，D＝干膏率／干膏率最大值）。结果见表2。

2.2 抗炎镇痛作用 本研究以小鼠耳廓肿胀、热板法、扭体法和大鼠足跖肿胀实验作为药效学评价指标，对4 种提取物抗炎镇痛作用进行考察［9］。

通过Graphpad prism 5.0 软件进行处理，数据以（±s）表示，2 组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析。以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2.2.1 二甲苯致小鼠耳廓肿胀实验 参考文献［10］报道，取雄性昆明种小鼠140 只，体质量（20±2）g，随机分为14 组，每组10 只，分别为醇提法、水提法、醇水双提法、挥发油双提法高、中、低剂量组（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松组（10 mg／kg），生理盐水组，连续灌胃给药7 d。末次给药0.5 h 后，用微量加样器于其右耳内外两侧均匀涂布二甲苯25 μL／侧，左耳不处理作为对照。2 h后脱颈椎处死，沿耳廓基部剪下双耳，用6.0 mm 打耳器在相同位置打下两圆耳片，各自称定质量，以两耳片质量之差为肿胀程度，并计算肿胀抑制率。结果表明，与生理盐水组比较，地塞米松组，醇提法低、中、高剂量组，水提法高剂量组，醇水双提法中、高剂量组，挥发油双提低、中、高剂量组小鼠耳廓肿胀度降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性，其中以醇提法高剂量组抗炎活性最强，见表3。

表3 清咽润喉复方对小鼠耳廓肿胀程度的影响（±s， n ＝10）

表3 清咽润喉复方对小鼠耳廓肿胀程度的影响（±s， n ＝10）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.2 角叉菜胶致大鼠足跖肿胀实验 参考文献［10］报道，取SD 大鼠140 只，雌雄各半，随机分为14 组，每组10 只，分别为分别为醇提法、水提法、醇水双提法、挥发油双提法高、中、低剂量组（18.20、9.10、4.55 g／kg），地塞米松组（10 mg／kg），生理盐水组，连续灌胃给药7 d。末次给药1 h 后，用足趾容积测量仪测其正常右后足跖容积，并于大鼠右后足跖皮下注入新鲜角叉菜胶0.1 mL／爪，分别于致炎后1、2、3、4、5、6 h 测定其右后足跖容积，计算肿胀值。结果表明，与生理盐水组比较，地塞米松组，醇提法低、中、高剂量组，水提法高剂量组，醇水双提法中、高剂量组，挥发油双提低、中、高剂量组大鼠足关节肿胀值降低（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性，其中醇提法、挥发油双提法高剂量组抗炎活性最强，见表4。

表4 清咽润喉复方对大鼠足趾肿胀值的影响（±s， n＝10）

表4 清咽润喉复方对大鼠足趾肿胀值的影响（±s， n＝10）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.3 小鼠热板法镇痛实验 参考文献［11］报道，取雌性昆明种小鼠140 只，体质量（20±2）g，随机分为14 组，每组10 只，分别为醇提法、水提法、醇水双提法、挥发油双提法高、中、低剂量组（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林组（200 mg／kg），生理盐水组，连续灌胃给药7 d。于末次给药后，以热板法（55±0.5）℃分别在30、60、120 min测量小鼠痛阈值。结果表明，与生理盐水组比较，阿司匹林组，醇提法低、中、高剂量组，水提法高剂量组，醇水双提法中、高剂量组，挥发油双提低、中、高剂量组小鼠痛阈值升高（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性，其中醇提法、挥发油双提法高剂量组活性最强，见表5。

表5 清咽润喉复方对小鼠热板性疼痛的影响（±s， n＝10）

表5 清咽润喉复方对小鼠热板性疼痛的影响（±s， n＝10）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

2.2.4 小鼠扭体法镇痛实验 参考文献［12］报道，取雄性昆明种小鼠140 只，体质量（20±2）g，随机分为14 组，每组10 只，分别为醇提法、水提法、醇水双提法、挥发油双提法高、中、低剂量组（18.20、9.10、4.55 g／kg），阿司匹林组（200 mg／kg），生理盐水组，连续灌胃给药7 d。末次药1 h 后，各组小鼠腹腔注射0.6% 冰醋酸0.1 mL／10 g。以小鼠腹部内凹，后肢伸直，臀部抬起，蠕行为指标，观察记录注射0.6%冰醋酸后15 min 内小鼠的扭体次数，并计算抑制率。结果表明，与生理盐水组比较，阿司匹林组，醇提法低、中、高剂量组，水提法高剂量组，醇水双提法中、高剂量组，挥发油双提低、中、高剂量组小鼠平均扭体次数减少（P＜0.05，P＜0.01），并呈剂量依赖性，其中醇提法、挥发油双提法高剂量活性最强，见表6。

表6 清咽润喉复方对小鼠扭体反应的影响（±s， n＝10）

表6 清咽润喉复方对小鼠扭体反应的影响（±s， n＝10）

注：与生理盐水组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

3 讨论

青果多酚具有较好的抗炎活性，青果多酚中没食子酸含量较多，故可选用没食子酸为清咽润喉复方的指标性成分［13］。研究发现，青果滨蒿内酯具有消炎止痛作用，故认为没食子酸、滨蒿内酯两者协同增效，从而发挥青果清热利咽的作用［14］。研究表明，荷叶主要活性成分生物碱抗炎作用最强［15-18］。综合以上因素考虑，本研究选择没食子酸、滨蒿内酯、荷叶碱为清咽润喉复方有效成分考察指标。可能由于没食子酸在水中的溶解度大，滨蒿内酯、荷叶碱在乙醇中的溶解度大，故本研究中双提法能将大量水溶性和醇溶性成分提出，增加出膏率，综合评分较高（99.39分）。

复方有效性是多成分综合作用的结果，本研究以小鼠耳廓肿胀、热板法、扭体法、大鼠足跖肿胀实验作为药效学评价指标，对复方提取方法进行优化［9］。结果表明，醇提法和挥发油双提法中、高剂量，醇水双提法高剂量组均对小鼠耳廓肿胀度有抑制作用（P＜0.01）；醇提法和挥发油双提法中、高剂量组均能减少小鼠平均扭体次数（P＜0.01）；醇提法和挥发油双提法中、高剂量组均能缓解大鼠足关节肿胀程度和提高小鼠的痛阈值（P＜0.01），其中醇提法和挥发油双提法所得提取液的抗炎镇痛作用最强。

综上所述，本研究通过对比清咽润喉复方不同提取方法有效成分含量和抗炎镇痛效果，证明挥发油双提法为该复方最佳提取方法，为进一步的提取工艺和相关新型产品研究开发提供理论与实验基础。