黄柏抗痛风活性部位筛选及其对腹膜炎小鼠的保护作用

魏梦佳丽马 倩 张 芳王 婧谭晓斌*

（1.南京中医药大学附属江苏省中西医结合医院，江苏 南京 210028； 2.国家中医药管理局中药释药系统重点研究室，江苏 南京 210028； 3.南京中医药大学，江苏 南京 210046）

痛风属代谢性风湿病范畴，主要是由于人体内嘌呤代谢紊乱和（或）尿酸排泄障碍，导致血尿酸水平长期超过人体代谢上限，从而形成单钠尿酸盐（monosodium urate，MSU）晶体，并沉积于关节和软组织等处引起高尿酸血症及痛风［1-2］。治疗痛风的药物主要有非甾体抗炎药、糖皮质激素等，但以上几类药物多具有严重的副作用，如秋水仙碱具有肾毒性。目前药物确实能控制病情发展，但存在缓解率低、复发率高、安全性差、长期疗效不稳定、并发症多等问题。因此，寻求更有效的治疗方法和药物迫在眉睫。

黄柏为芸香科植物黄皮树Phellodendri chinensisSchneid.的干燥树皮，习称“川黄柏”，剥取树皮后，除去粗皮，晒干［3］。黄柏具有抗痛风、免疫调节、抗炎抑菌、抗真菌、抗氧化和抗肿瘤等药理作用，其主要化学成分有生物碱类、黄酮类、酯类、甾醇类、微量元素等［4-6］，其中生物碱类是黄柏的主要有效成分，含量达3%以上，主要有小檗碱、黄柏碱、药根碱、蝙蝠葛任碱、白瓜蒌碱、木兰花碱、掌叶防己碱等［7-8］。但是对于黄柏抗痛风有效部位及其机制研究尚未阐明，因此，本研究拟通过脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）和MSU 两步刺激建立细胞痛风模型，考察黄柏不同极性部位的抗痛风活性，并研究其对小鼠体内抗痛风的药效学及机制初探，旨在为黄柏下一步开发利用奠定研究基础。

1 材料与方法

1.1 仪器 ML304T 型电子天平［梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司］；5428 型冷冻离心机（德国Eppendorf 公司）；RE-5203 型旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂）；SHZ-D Ⅲ型循环水式真空泵（巩义市予华仪器有限责任公司）；SPECTRA MAX 190 型酶标仪（美国Molecular Devices 公司）；TH4-200 型荧光倒置显微镜（日本Olympus 公司）；HERA cell150i 型细胞培养箱（美国 Thermo Scientific 公司）；Class Ⅱ型生物安全柜（德国Labconco 公司）；DW-86L5788 型－80 ℃超低温冰箱（海尔集团公司）；Gallios 流式细胞仪（美国Beckman 公司）。

1.2 试剂与药物 黄柏（批号191217，江苏华洪药业科技有限公司），经南京中医药大学陈建伟教授鉴定为芸香科植物黄皮树的干燥树皮。盐酸小檗碱（纯度≥86.7%，批号110713-201814，中国食品药品检定研究院）；肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）ELISA 试剂盒（批号4291149，美国 eBioscience 公司）；白介素-1β（interleukin-1β，IL-1β）ELISA 试剂盒（批号DY008，美国R＆D 公司）；CCK-8 试剂盒（批号KH741，日本Dojindo 公司）；胎牛血清（批号0814，韩国DCELL Biologics 公司）；RPMI-1640 培养基（含双抗）、DMEM 培养基（含双抗）（批号20210310、20210502，江苏凯基生物技术股份有限公司）；巨噬细胞集落刺激因子（M-CSF，批号D1921，美国Peprotech 公司）；2-巯基乙醇、巯基乙酸酯、尿酸（批号M3148、70157、U2625，美国Sigma 公司）；中性红（批号01087566，瑞士Adamas-beta 公司）；荧光抗体F4／80-APC、CD11b-Pacific Blue、Ly6G-PE（美国Biolegend 公司）。水为娃哈哈纯净水；石油醚等其他试剂均购自南京化学试剂股份有限公司。

1.3 实验动物 清洁级雄性C57BL／6 小鼠，6～8周龄，由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证号SCXK（京）2019-0010，饲养于江苏省中医药研究院，本实验已获得江苏省中医药研究院伦理委员会批准。

1.4 黄柏不同极性部位制备 称取黄柏饮片400 g，分别加入10、8 倍量70% 乙醇回流提取2次，每次2 h，合并提取液，减压回收乙醇，浓缩至75 mL，分别用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯、水饱和的正丁醇等体积萃取3 次，合并有机相，蒸干，加50 mL 乙醇溶解至含黄柏生药量8 g／mL 备用，即得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位。

1.5 尿酸钠晶体制备 4 g 尿酸溶解在800 mL 1 mol／L NaOH 溶液中，加热煮沸，缓慢搅拌至尿酸完全溶解，停止加热，用HCl 将溶液pH 调节至7.2，室温下搅拌使溶液逐渐冷却，4 ℃过夜，5 000 r／min 离心5 min 以回收MSU 晶体，蒸馏水洗涤，小心收集晶体，40 ℃干燥24 h。每次实验前将MSU 晶体研磨，180 ℃加热2 h 灭菌，并保存在无菌环境中备用［9-10］。

1.6 MSU 诱导小鼠腹腔巨噬细胞痛风模型的建立 小鼠腹腔注射1 mL 3%巯基乙酸酯，4 d 后脱颈椎处死，75%乙醇浸泡消毒后转移至生物安全柜中，腹腔注射5 mL DMEM 培养基，轻轻按摩腹部3 min，剪开腹腔，吸出腹腔灌洗液，2 000 r／min离心2 min，弃上清，用5 mL DMEM 培养基重悬，调整细胞密度为1×106／mL［11］。取上述细胞悬液接种于48 孔板中，每孔500 μL，2 h 后吸去上清，弃上层未贴壁细胞，加入新DMEM 培养基，得到贴壁的腹腔巨噬细胞，放入37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育过夜，1 μg／mL LPS 刺激5 h，再分别加入10 μmol／L 盐酸小檗碱、500 μg／mL 黄柏醇提液及不同极性部位，给药30 min 后给予100 μg／mL MSU 刺激18 h，ELISA 法检测上清液中IL-1β、TNF-α 水平［12］。

1.7 MSU 诱导小鼠骨髓来源巨噬细胞（BMDM）痛风模型的建立 小鼠颈椎脱臼处死，75%乙醇浸泡消毒后转移至生物安全柜中，取出股骨与胫骨，置于装有5 mL RPMI-1640 完全培养基（含2-巯基乙醇）的表面皿中，反复冲洗股骨与胫骨直至发白，收集培养基，2 000 r／min 离心2 min，弃上清，加入1 mL ACK 红细胞裂解液裂解30 s，立即加入5 mL 培养基终止，2 000 r／min 离心2 min，弃上清，培养基洗2 次，重悬，调整细胞密度为2×106／mL。取上述细胞悬液12 mL，加 入50 ng／mL M-CSF，每孔2 mL 接种于6 孔板中，为培养的第0 天；第3 天，吸弃上清液，加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640 培养基；第5 天，直接加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640培养基；第7 天，吸弃一半上清液，加入12 mL 含50 ng／mL M-CSF 的RPMI-1640 培养基；第8 天，收集细胞，2 000 r／min 离 心2 min，弃上清，RPMI-1640 培养基重悬，并调整细胞密度为1×106／mL。取上述细胞悬液接种于48 孔板中，每孔500 μL，1 μg／mL LPS 刺激5 h，再分别加入10 μmol／L 盐酸小檗碱、500 μg／mL 黄柏不同极性部位，给药30 min 后给予100 μg／mL MSU 刺激18 h，ELISA 法检测上清液中IL-1β、TNF-α 水平［12-13］。

1.8 腹腔巨噬细胞及BMDM 细胞存活率检测 取“1.6” “1.7” 项下细胞悬液接种于96 孔板中，每孔200 μL，置于37 ℃、5% CO2细胞培养箱中孵育2 h，吸弃上清，用培养基洗3 次，加入阳性药10 μmol／L 盐酸小檗碱、500 μg／mL 黄柏醇提液及不同极性部位，继续放入培养箱中培养24 h，每孔加入10 μL CCK-8 溶液，培养2 h，于酶标仪450 nm波长处测定吸光度（OD）值。

1.9 腹腔巨噬细胞吞噬能力检测

1.9.1 黄柏活性部位吞噬中性红能力 取“1.6”项下腹腔巨噬细胞，调整密度为1×106／mL，接种于96 孔板中，每孔100 μL，培养2 h 后吸弃上清，去除未贴壁细胞，加入新培养基，放入37 ℃、5%CO2细胞培养箱中孵育过夜，给予1 μg／mL LPS 刺激（空白组不给予），分别加入10 μmol／L 盐酸小檗碱、500 μg／mL 黄柏正丁醇部位培养24 h，吸弃上清，加入200 μL 0.05%中性红溶液，1 h 后吸弃上清，PBS 洗1～2 次，加入100 μL 细胞裂解液（50%乙醇、1%乙酸、49%水）释放中性红，摇床振荡15 min后于酶标仪540 nm 波长处检测光密度（OD）值，中性红吞噬率＝OD给药组／OD空白组［14-17］。

1.9.2 黄柏活性部位对巨噬细胞吞噬MSU 晶体能力的影响 按“1.6” 项下方法建立腹腔巨噬细胞痛风模型，MSU 刺激18 h 后吸弃培养基，PBS 洗2 次，荧光倒置显微镜下观察，MSU 晶体清晰可见，确定每组细胞中吞噬MSU 细胞的百分比，共检查4～5 个区域的至少100 个细胞，MSU 晶体吞噬率＝（给药组吞噬MSU 细胞数量／空白组吞噬MSU 细胞数量）×100%［18-19］。

1.10 MSU 诱导小鼠腹膜炎模型的建立 小鼠随机分为空白组、模型组、盐酸小檗碱组及正丁醇部位低、中、高剂量组，其中盐酸小檗碱组和正丁醇部位低、中、高剂量组给药剂量分别为0.02、5、10、20 g／kg，连续灌胃给药3 d，空白组和模型组灌胃等量生理盐水。给药第3 天后，除空白组外均腹腔注射0.5 mL 含3 mg MSU 的PBS，6 h 后颈椎脱臼处死小鼠，75%乙醇浸泡消毒后转移至生物安全柜中，腹腔注射5 mL 冰PBS，轻柔按摩3 min，小心剪开腹膜，吸出腹腔灌洗液，2 000 r／min 离心2 min，吸弃上清液，ELISA 法检测上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平。下层细胞用5 mL PBS 重悬，计数，收集于流式管中，2 000 r／min 离心5 min，150 μL PBS 重悬，加入荧光抗体F4／80-APC、CD11b-Pacific Blue、Ly6G-PE 于冰上暗处染色20 min，直接加入2 mL PBS 洗涤，2 000 r／min离心5 min，弃上清，150 μL PBS 重悬，流式细胞仪检测中性粒细胞募集程度［20-22］。

1.11 统计学分析 通过SPSS 19.0 软件进行处理，实验数据以（±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。P＜0.05 表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 黄柏不同极性部位对小鼠腹腔巨噬细胞及BMDM 细胞存活率的影响 黄柏不同极性部位组小鼠腹腔巨噬细胞及BMDM 细胞存活率与空白组比较差异无统计学意义（P＞0.05），表明黄柏不同极性部位对这2 种细胞均无毒性，见图1。

图1 黄柏不同极性部位对小鼠腹腔巨噬细胞（A）及BMDM 细胞（B）存活率的影响（±s， n＝3）Fig.1 Effects of different polar parts of P.chinensis Cortex on viability of mouse peritoneal macrophages（A）and BMDM cells（B）（±s， n＝3）

2.2 黄柏不同极性部位对小鼠腹腔巨噬细胞分泌IL-1β、TNF-α 的影响 与空白组比较，模型组（1 μg／mL LPS 及100 μg／mL MSU 刺激）小鼠腹腔巨噬细胞上清液中IL-1β、TNF-α 水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，阳性药盐酸小檗碱组、黄柏醇提液及正丁醇部位组细胞IL-1β 水平均降低（P＜0.01），但各给药组TNF-α 水平均无明显变化（P＞0.05），见图2。

图2 黄柏不同极性部位对小鼠腹腔巨噬细胞IL-1β、TNF-α 水平的影响（±s， n＝3）Fig.2 Effects of different polar parts of P.chinensis Cortex on IL-1β and TNF-α levels of mouse peritoneal macrophages（±s， n＝3）

2.3 黄柏不同极性部位对BMDM 细胞分泌IL-1β、TNF-α 的影响 与空白组比较，模型组BMDM 细胞上清液中IL-1β、TNF-水平升高（P＜0.01）；与模型组比较，盐酸小檗碱组、石油醚部位和正丁醇部位组BMDM 细胞IL-1β 水平降低（P＜0.05，P＜0.01），但各给药组TNF-α 水平均无明显变化（P＞0.05），见图3，提示正丁醇部位为黄柏醇提液的活性部位。

2.4 黄柏活性部位对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响 与对照组比较，正丁醇部位组和盐酸小檗碱组巨噬细胞对中性红的吞噬能力均减弱（P＜0.01）；给予LPS 刺激后，正丁醇部位组和盐酸小檗碱组较模型组对中性红的吞噬能力仍受到抑制（P＜0.01），见图4。

图4 黄柏活性部位对巨噬细胞吞噬中性红能力的影响（±s， n＝3）Fig.4 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on phagocytosis of neutral red in macrophages（±s， n＝3）

2.5 黄柏活性部位对巨噬细胞吞噬MSU 晶体能力的影响 巨噬细胞给予1 μg／mL LPS 及100 μg／mL MSU 刺激后，显微镜下观察到大多数细胞吞噬MSU 晶体（图5A）。与模型组比较，正丁醇部位组和盐酸小檗碱组巨噬细胞吞噬MSU 晶体的能力受到抑制（P＜0.01），见图5B，提示这可能是导致下游IL-1β 分泌减少的原因之一。

图5 黄柏活性部位对巨噬细胞吞噬MSU 晶体能力的影响（±s， n＝3）Fig.5 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on phagocytosis of MSU crystal in macrophages（±s， n＝3）

2.6 黄柏活性部位对MSU 诱导小鼠腹膜炎模型的影响 如图6A～6C 所示，与模型组比较，盐酸小檗碱组和正丁醇部位各剂量组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6 水平降低（P＜0.01），其中正丁醇部位高剂量组效果最明显，但各给药组TNF-α 水平均无明显变化（P＞0.05）。如图6D～6E 所示，与模型组比较，盐酸小檗碱组和正丁醇部位中、高剂量组中性粒细胞募集程度降低（P＜0.05，P＜0.01）。

图6 黄柏活性部位对MSU 诱导小鼠腹膜炎模型的影响（±s， n＝6）Fig.6 Effects of active fraction of P.chinensis Cortex on MSU-induced peritonitis mouse models（±s， n＝6）

3 讨论

痛风是一种自身炎症性疾病，是由感染或自身免疫性原因引起的周期性炎症［23］。研究发现IL-1β在痛风发作的启动过程中起着关键作用［24-25］。IL-1β 也被称为内源性热原，是一种炎症性细胞因子，其产生受到3 个步骤的严格控制，首先是产生pro-IL-1β；接着是裂解前体pro-IL-1β 以产生活性IL-1β；最后IL-1β 被释放到细胞外环境中，其中裂解pro-IL-1β 主要涉及激活caspase-1 复合物，这也是炎性小体最大的功能特征［26-27］。

炎性小体复合体通常包含胞质模式识别受体（PRR）、接头蛋白（ASC／TMS1）和pro-caspase-1。在暴露于病原体相关模式分子（PAMP）或危险相关模式分子（DAMP）之后，炎性小体在胞质中完成组装，激活caspase-1 以及后续裂解pro-IL-1β 和pro-IL-18，释放活性炎症因子IL-1β 和IL-18［28］。而TNF-α 属于非炎性小体依赖性细胞因子，其释放与炎性小体无关。

巨噬细胞被认为是启动和驱动MSU 晶体引发炎症的关键细胞［29-30］。因此，本实验选用小鼠腹腔巨噬细胞及骨髓来源巨噬细胞建立痛风细胞模型。结果显示，黄柏正丁醇部位可抑制IL-1β 的分泌，而其他部位均无明显作用，提示正丁醇部位为黄柏抗痛风的活性部位，但各给药组均不能降低TNF-α 水平，提示其抗痛风作用机制与炎性小体有关。

巨噬细胞是重要的免疫细胞之一，在宿主防御系统中起着至关重要的作用。因此，本实验通过中性红吞噬实验及MSU 晶体吞噬实验探索正丁醇部位对巨噬细胞吞噬能力的影响。结果显示，各给药组均可抑制巨噬细胞的吞噬能力，提示其抗痛风作用机制可能是降低细胞吞噬MSU 晶体的能力，从而减少IL-1β 等细胞因子释放。

痛风炎症的特征是MSU 晶体沉积导致中性粒细胞募集，因此本实验通过小鼠MSU 腹膜炎模型考察腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6、TNF-α 水平，流式细胞术分析中性粒细胞募集程度的变化。结果显示，与模型组比较，正丁醇部位各剂量组小鼠腹腔灌洗液中IL-1β、IL-6 水平降低，其中正丁醇部位高剂量组效果最明显，但各组TNF-α 水平均无明显变化；各给药组F4／80－CD11b＋Ly6G＋标记中性粒细胞募集程度降低。

综上所述，正丁醇部位为黄柏抗痛风活性部位，其抗痛风作用机制可能是通过降低细胞吞噬MSU 晶体的能力，从而减少IL-1β、IL-6 等细胞因子释放，进而减少中性粒细胞募集程度，改善痛风症状。