泛素羧基端水解酶-5在妇科恶性肿瘤中的相关性研究进展

莫 凡,李丹青,杨英捷△

(1.贵州医科大学临床医学院妇产科学教研室,贵州 贵阳 550004;2.贵州医科大学附属肿瘤医院,贵州 贵阳 550000)

妇科肿瘤是威胁女性身体健康的主要疾病,全球肿瘤统计报告显示,2020年全球妇科恶性肿瘤的新发病人数超过139.8万,病死人数高达67万,给女性健康和社会带来了沉重负担[1]。因此,不断探索妇科肿瘤其发病机制,靶点药物研发是亟待解决的关键问题。在维持细胞蛋白质的稳态中泛素化与去泛素化修饰为两种重要方式,而蛋白质稳态平衡被破坏是许多细胞功能异常和诸多疾病如肿瘤发生的表征及起因。泛素羧基末端水解酶家族(ubiquitin C-terminal hydrolases,UCHs)它是去泛素化酶(deubiquitinases, DUBs)的主要成分之一。人类UCHs亚家族成员主要有4个,分别是UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5(又称为UCH37)和BRCA1相关蛋白(BAP1)。对比GTEx数据库和TCGA数据库的癌基因组,UCH-L5的突变量要远高于UCH-L1和UCH-L3,这提示在肿瘤的发生发展中,UCH-L5可能发挥着更主要的作用[2]。本文将综述UCH-L5的结构、功能及在妇科恶性肿瘤方面的研究进展。

1 泛素-蛋白酶体系统

泛素(ubiquitin)广泛分布于真核生物中,它是由76个氨基酸组成、分子量约为8.5 kDa的一类在进化上非常保守且具有蛋白质翻译后修饰功能的小蛋白分子[3]。1975年泛素被Goldstein等最先发现,在之后的十余年中进一步被证实。其羧基端会通过异肽键结合到底物蛋白的赖氨酸残基上,称为泛素化修饰。泛素化修饰的过程由一系列酶促级联反应进行催化完成,涉及的酶主要包括:泛素激活酶E1、泛素耦联酶E2 及泛素连接酶E3。首先在ATP的参与下,E1与泛素C末端耦联形成高能磷酸键,泛素被激活;活化后的泛素被转移到E2活性半胱氨酸残基上,而E3则将结合E2的泛素连接到靶蛋白尾端形成一小段泛素分子链。而26S蛋白酶体可特异性的识别带有泛素标记的蛋白,并将其降解,泛素则释放而被回收[4]。泛素-蛋白酶降解系统是细胞内蛋白质降解的重要途径之一,主要负责降解细胞内的超过80%正常或异常蛋白质。介导细胞内多种生理过程调控,如DNA转录和修复、核糖体生成、离子通道、细胞凋亡等,它的异常也将会导致人类严重的疾病。

2 去泛素化酶概述

泛素化调节过程高度可逆,且具有较强的特异性,多种去泛素化酶分布于细胞内,可以切开泛素与赖氨酸或泛素与蛋白质N端甲硫氨酸的链接,将泛素从底物蛋白上去除并游离多泛素链形成单泛素链,从而拮抗泛素化修饰的作用并回收利用泛素分子,阻止靶蛋白被过度降解。去泛素化酶参与许多生物学过程,如转录调控、生长、分化及肿瘤发生等[5]。据估计,去泛素化酶(DUBs)家族在人类细胞中有大约100个,由7 个家族组成,分别是泛素羧基末端水解酶(UCHs)、卵巢肿瘤蛋白酶(OTUs)、Machado-Josephin 结构域的蛋白酶(MJDs)、单核细胞趋化蛋白诱导蛋白(MCPIPs)、泛素特异性蛋白酶(USPs)、JAMM/MPN结构域相关的金属多肽酶(JAMMs)、以及最新发现的锌指UFM1特异性多肽酶结构域蛋白(ZUFSP)。目前为止发现的人类UCHs亚家族成员主要有4个,分别是UCH-L1、UCH-L3、UCH-L5/UCH37和BRCA1相关蛋白(BAP1)。它们的特点是都具有一个约由230个氨基酸组成的催化核心结构域(称UCH -结构域)。晶体结构的研究结果显示,UCH-结构域含有三个保守的残基:半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸。UCHs含有一个活性位点交叉环,交叉环的大小限制了底物大小,因此,UCHs倾向于从泛素的C端切割相对较小的蛋白质底物[6]。

3 UCH-L5的结构与功能

UCH-L5结构全长包含329个氨基酸,在序列上与UCH-L1、UCH-L3具有高度同源性,包含一个N末端UCH结构域(残基1～226)及一个延伸的C末端尾部(残基227～329),研究发现,UCH-L5的C末端存在一段独特的氨基酸序列,称为KEKE模序,从而在蛋白质性质和功能上与前二者存在一定差异[6]。研究显示UCH-L5的晶体结构由一个中心六链反平行结构片组成,在片的两侧各有七个螺旋链,形成双叶结构。左叶催化残基His164和Asp179分别位于3号链和4号链的氨基末端和羧基末端。右叶催化位点残基Cys88Ala位于Helix4的氨基末端。UCH-L5的活性部位位于两叶间的中心裂隙处。三个残基(半胱氨酸、组氨酸和天冬氨酸)组成了木瓜蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶家族特有的催化三联体。

UCH-L5溶解状态时,常呈二聚体或四聚体形式,C末端结构域相互覆盖并阻碍其与泛素的结合,功能上处自抑制状态。UCH-L5主要通过26S蛋白酶体和INO80染色质重塑复合体发挥其功能。非ATP酶调节亚基13(Rpn13)又称黏附调节分子1(ADRM1),是26S蛋白酶体的一个亚基,其N末端与多聚泛素链结合,而C末端也含有KEKE模序。UCH-L5与Rpn13通过各自的KEKE模序相连接,使UCH-L5自抑制解除,并招募到蛋白酶体中,分解多聚泛素链,从而阻止靶蛋白的降解[7]。Song等[8]研究表明细胞中蛋白体多聚支链泛素(Ub)聚合物,可激活UCH-L5(UCH37)活性,直接结合支链Ub的远端疏水部分,通过Rpn13招募UCH-L5到蛋白体结合支链Ub和去泛素化增强并增加蛋白酶体对底物的清除作用,缺少UCH-L5会影响Ub的再循环,影响下一轮的降解过程。

而UCH-L5与转录相关的INO80结合则是通过核因子相关KB结合蛋白(NFRKB)。NFRKB是INO80复合物的一个亚基,与Rpn13不同的是,UCH-L5与NFRKB结合后,其活性进一步受到抑制。造成这种不同的原因在于Rpn13和NFRKB各自与UCH-L5 UCH结构域的相互作用不同。NFRKB与UCH-L5结合的同时,其F100环结构阻挡了UCH-L5的泛素结合位点并使UCH-L5的活性位点受到扭曲从而失去活性[9]。然而,在遇到Rpn13或26S蛋白酶体时,UCH-L5可重新被激活。目前UCH-L5在高级真核生物INO80复合物中的作用以及INO80复合体与蛋白酶体之间存在何种功能上的联系,仍有待进一步研究。

4 UCH-L5与妇科恶性肿瘤

DUBs作用的靶蛋白包含转录因子、信号传导分子等,而其中有些已经证实是促癌因子或是抑癌因子,如P53、TGF-β、EGFR、Wnt等,从而调控细胞生物学进程,如细胞周期、凋亡等,来影响癌症的发生[10]。在肿瘤不同类型的发生发展中,各DUBs发挥的作用不同:如UCH-L1、UCH-L3和UCH-L5多扮演促瘤因素的角色,而BAP1在多种肿瘤中发挥抑癌作用[11]。

4.1 UCH-L5与宫颈癌宫颈癌是女性恶性肿瘤中发病率及病死率最高的疾病之一,虽然宫颈癌早期筛查技术普及和治疗手段的提升,预后得到了显著的改善,但是,根据世界卫生组织的数据,每年仍然超过50万的新发病例。靶向治疗可以通过标志物的表达针对性的进行治疗,这也是近年来最有潜力的治疗方式。因此对于宫颈癌潜在治疗靶点的寻找,对改善宫颈癌患者预后有着重要临床意义。

人乳头状瘤病毒(HPV)感染和宫颈癌的发生存在显著的关系。高风险HPV(如HPV16、HPV18)感染后,通过三个步骤来启动癌症的发生发展:病毒DNA整合到宿主基因组,病毒癌蛋白(E6和E7)在上皮细胞中表达,以及病毒癌蛋白与细胞蛋白相互作用。众所周知的致癌模型是,HPV表达癌蛋白E6和E7,E6与E6相关蛋白(E6-AP)结合后,促使抑癌蛋白P53通过泛素-蛋白酶体途径降解,E6-AP也是E6 蛋白激活端粒酶的活性调节者与宫颈癌的进展密切相关[12];E7则通过泛素-蛋白酶体途径使qRb失活降解,将分化细胞保留在DNA合成状态,中断细胞周期控制并启动基因转录[13]。E6和E7与大量细胞蛋白发生互相作用,而这些蛋白参与了细胞恶性表型的发展,其中一个重要的蛋白为β-catenin[14]。β-catenin是Wnt/β-catenin信号通路的关键成分,主要参与细胞-细胞黏附和信号转导。Wnt信号在未激活时,胞浆中β-catenin一部分与胞膜上的钙粘蛋白(E-caderin)相结合,一部分则与细胞质内Axin、APC和糖原合酶激酶3β(GSK3β)形成的降解复合体结合而被磷酸化,磷酸化的β-catenin被泛素连接酶E3识别,最终通过泛素化修饰被降解。在Wnt信号激活时,胞质中的Dsh蛋白被招募至胞膜下,使GSK3β磷酸化失活,β-catenin不能被降解而聚集,进入细胞核内结合TCF/LEF转录因子家族,启动Wnt靶基因的转录[15]。β-catenin过度积累会引起Wnt/β-catenin信号的过度激活,从而导致肿瘤形成,促进肿瘤的侵袭与转移。因此,保证细胞质中的游离态β-catenin正常降解是维持着细胞稳态的关键[16]。Rolén等人对比了宫颈癌患者的癌组织和邻近正常组织的多种去泛素化酶水平,结果发现宫颈癌组织的UCH-L5水平显著高于邻近正常组织[17]。将UCH-L5水平与患者临床病理特征进行相关分析,也表明UCH-L5的表达水平与宫颈癌患者FIGO分期及淋巴转移情况呈正相关[18]。采用CRISPR/Cas9 敲除宫颈癌Hela细胞的UCH-L5,发现细胞内Rpn13水平显著下降,泛素化的β-catenin水平升高,β-catenin降解过程显著加快[19],这说明宫颈癌的发生可能与UCH-L5的增高使β-catenin泛素化降解减少,游离态β-catenin堆积,从而过度激活Wnt/β-catenin信号有关。

至今已发现数十种Wnt/β-catenin靶基因,如c-Myc、FOXOs、Smad、Oct4等与细胞增殖调控基因、发育控制基因和肿瘤发生相关的原癌基因、细胞周期蛋白D1、MMP7及血管内皮生长因子等,在结直肠癌、肺癌、肝癌、胃癌等多种癌症中均显示出重要意义[20]。对Wnt/β-catenin信号通路的核内信号转导过程进一步研究后发现,UCH-L5敲除主要抑制了Wnt信号靶基因siamois和Xnr3的表达;同时,下游基因如c-Myc和Cyclin D1的表达也显著下降,从而抑制了肿瘤细胞的迁移和增殖[19,21],WonheeHan等[22]观察到不同的结果,发现宫颈癌Hela细胞中UCH-L5以剂量依赖的方式抑制Wnt信号靶基因,如Axin1和c-myc的表达,降低活性βcatenin的水平,负调控βcatenin上游的Wnt信号通路。但并未观察到在UCH-L5缺失条件下Wnt信号通路过度激活导致更具侵袭性的癌症进展,且下调UCH-L5虽然促进了Wnt信号的活性,但却抑制了癌细胞的生长。焦圣元等[23]研究表明,缺氧刺激可通过诱导HIF-1a的表达,进而激活UCH-L5表达增强,增强Hela细胞的增殖能力,从而降低了细胞的辐射敏感性,这表明UCH-L5可以促进宫颈癌的辐射抗性,靶向缺氧诱导UCH-L5的特异性抑制剂可能成为一种潜在放疗增敏剂。而沉默Hela细胞的UCH-L5,可使其细胞周期停滞于G1期[18]。这表明UCH-L5的表达不仅可诱发宫颈癌肿瘤的发生,还可能是部分宫颈癌放射治疗耐受的重要机制之一。

4.2 UCH-L5与卵巢癌卵巢癌因其临床症状常不典型,大多数患者确诊时已属于晚期。目前,卵巢癌发病机制尚不明确。上皮性卵巢癌约占所有卵巢癌的80%,虽然目前有手术、化疗、放疗等治疗手段, III、IV期的上皮性卵巢癌患者的预后仍较差。

Wang等通过用免疫印迹法检测UCH-L5在卵巢癌组织和正常组织中的表达水平。并对卵巢癌患者的肿瘤标本中UCH-L5的表达与预后的关系进行了分析发现UCH-L5在大多数肿瘤组织中表达上调,且UCH-L5的表达水平与肿瘤分化程度呈反比。同时,UCH-L5水平较高的患者总体生存期(OS)和无病生存期(DFS)显著短于UCH-L5水平低的患者[24]。对来自cBioportal数据库的多种癌症基因组进行分析,结果显示UCH-L5的基因变异非常频繁,尤其是乳腺癌和高级别浆液性卵巢癌。使用癌症基因组图谱(TCGA)数据库进行分析,同样也表明高级别浆液性卵巢癌患者1q31.1-1q31.2染色体上存在UCH-L5基因扩增子,且UCH-L5的拷贝数与其mRNA的表达水平也显著相关。UCH-L5 mRNA表达水平与卵巢癌患者无进展生存(PFS)较差相关,尤其是在TP53突变卵巢癌患者中,UCH-L5 mRNA表达水平的差异更为显著。而UCH-L5抑制剂bAP15呈剂量依赖性抑制卵巢癌细胞生长并诱导肿瘤细胞凋亡[19]。

进一步研究表明,UCH-L5诱导卵巢肿瘤发生发展与转化生长因子β(TGF-β)信号通路密切相关。TGF-β是一类与多种肿瘤相关的细胞生长调节因子,可促进肿瘤的侵袭性和转移扩散[25]。UCHL5可通过Smad7、Smad2和Smad3调节TGF-β通路。通常情况下,Smad7可将泛素化连接酶Smurf1或Smurf2招募到TGF-β受体,诱导其快速经泛素-蛋白酶体系统降解,UCH-L5可通过与Smurf2竞争而与Smad7结合,阻止TGF-β受体的降解,从而导致TGF-β信号上调。同时,UCH-L5敲低可选择性降低TGF-β依赖的靶基因P21、PAI-1及MMP-2的活性,而P21、PAI-1和MMP-2对肿瘤的增殖和迁移具有抑制作用[9,26]。此外,UCH-L5同样也可通过减少Smad2/Smad3的降解而上调TGF-β信号通路[27]。bAP15处理后,TGF-β诱导的卵巢肿瘤细胞磷酸化Smad2显著降低。同样地,敲低UCH-L5也可显著抑制TFG-β诱导的Smad2磷酸化。采用HA标记泛素质粒转染肿瘤细胞后,使用抑制剂bAP15或shRNA敲除UCH-L5,观察Smad2的泛素化显著增加,这进一步明确了UCH-L5抑制剂的Smad2去磷酸化作用依赖于其对胞内蛋白的泛素化作用[28]。这些发现表明,抑制UCH-L5为针对转化生长因子-β激活的卵巢癌的新的靶向治疗提供了潜在的机会。

4.3 UCH-L5与子宫内膜癌(EC)EC是发生在子宫内膜的上皮性恶性肿瘤,占女性生殖道中恶性肿瘤的20%～30%,据2019年国家癌症中心统计,中国子宫内膜癌发病率为 10.28/10万,死亡率为1.9/10万,近年,在世界范围内发病率成上升趋势。晚期和复发性子宫内膜癌的治疗仍是亟待解决的临床问题之一。因此,确定EC发生和发展的潜在分子机制对于开发新的治疗策略非常必要。

LIU等[29]对比TCGA数据库中的548个EC组织和35个正常子宫内膜组织后发现,与非肿瘤标本相比,EC组织中UCH-L5的mRNA表达水平显著升高,且UCH-L5 mRNA水平低的患者总体生存期明显高于UCH-L5 mRNA水平高的患者。随后,他们检测了临床标本中UCH-L5的蛋白量,与生物信息学结果一致的是,WB检测UCH-L5蛋白在内膜癌组织中较相邻正常组织呈显著过表达状态。采用qPCR和WB检测4种人内膜癌细胞株与内膜上皮细胞株中UCH-L5的表达,结果均提示内膜癌细胞株的UCH-L5呈不同程度高于内膜上皮细胞株。敲低UCH-L5后,内膜癌细胞株相对活力下降,细胞凋亡增加,同时细胞周期停滞于G1期。此外,TCGA生物信息富集化结果显示CTNNB1 (β-catenin编码基因)富集与UCHL5基因相关。过表达UCH-L5,内膜癌细胞的β-catenin及其下游CyclinD1、C-myc及抗凋亡蛋白Survivin表达增加;而敲低UCH-L5后,内膜癌细胞的β-catenin水平及上述下游分子表达显著受抑制,凋亡相关蛋白cleaved-caspase 3水平显著增加,以上提示UCH-L5可能通过β-catenin途径促进内膜癌的发生发展。将稳定转染UCH-L5 shRNA慢病毒颗粒的内膜癌细胞株皮下注射到雌性裸鼠体内。UCHL5沉默明显抑制裸鼠异种移植瘤的大小、体积和重量。HE染色显示UCH-L5基因敲除组的肿瘤分化形态和角化程度均优于对照组。与上述体外实验结果一致的是,UCH-L5沉默导致β-catenin及其靶基因CyclinD1、C-myc和Survivin的减少,而在体内则导致cleaved-caspase3的增加。

NEDD4是属于HECT家族的泛素连接酶,主要通过在内质网、溶酶体和蛋白酶体中以泛素化依赖性方式介导蛋白降解来发挥其生物学作用。UCH-L5与 NEDD4直接存在相互作用,UCH-L5可通过NEDD4促进PRDX1的泛素化降解,减少其与c-Myc的结合,致使c-Myc在细胞核内聚集,促进癌症的发生发展[30]。同时,NEDD4在子宫内膜癌组织中表达显著增加,其水平随着炎症及子宫内膜癌的进展而增加[31];而内膜癌组织的PRDX1蛋白水平较癌旁组织降低[32],这提示UCH-L5可能是通过NEDD4-PRDX1从而促进子宫内膜癌的进展。此外,人子宫内膜癌细胞(Ishikawa细胞)过表达NEDD4后,可诱导IGF-1R在细胞表面的表达,并激活PI3K/Akt信号通路,而PI3K通路的激活是侵袭性子宫内膜癌的标志之一[33]。由此可见,NEDD4作为泛素连接酶,可能是UCH-L5促进子宫内膜癌发生发展的关键因素之一。

综上所述,泛素化-去泛素化系统作为调节细胞内蛋白质稳态的两个重要方式,调控着众多生命活动,包括细胞增殖、生长、分化、凋亡、修复等。UCH-L5作为泛素羧基末端水解酶家族的主要成员,通过精确调控蛋白质的降解过程,在妇科恶性肿瘤的发生及发展中起着关键作用。关于UCH-L5的研究,目前尚处于起步阶段,随着研究的深入,其对于妇科恶性肿瘤的作用会有更为全面的认识,为妇科肿瘤病因、诊断、治疗及预防提供思路与靶点。