外泌体在感音神经性聋中的作用研究进展

孟 雨,王 雪,陈 放,路钧泽,王 嫚,刘闻闻

(1. 山东省耳鼻喉医院耳鼻咽喉头颈外科,山东大学,山东 济南 250022;2. 山东省耳鼻喉研究所,山东 济南 250022)

耳聋是人类最常见的感官缺陷疾病之一,据世界卫生组织最新统计,全世界有超过4.66亿人患有听力损失[1],并有发展为抑郁和痴呆等相关共病的风险[2]。感音神经性聋(sensorineural hearing loss,SNHL)的病因和发病机制复杂多样,其主要的病理改变是耳蜗毛细胞和螺旋神经节神经元的功能异常和损伤,然而这些细胞均为终末分化细胞,损伤后难以修复再生,由此导致SNHL一旦发生即为永久性[3,4]。目前,SNHL的治疗尚无有效药物,主要基于助听器和人工耳蜗植入等替代疗法恢复部分听力,但因可能引起异物反应和急慢性炎症,影响其长期疗效[5]。

外泌体来源广泛、数量多并且稳定存在于几乎所有体液中;同时具有其亲本细胞的某些特征,参与多种生理和病理过程[6-8],有望成为多种疾病早期诊断的生物标志物[9],因此被称为"液体活检"。不仅如此,外泌体还综合了细胞药物递送和纳米技术的优势,被认为是极具潜力的新型生物载体。本文主要对外泌体在感音神经性聋发生发展中的作用和潜在临床应用价值的研究进展进行阐述。

1 外泌体

外泌体是一种由细胞内多囊体与细胞膜融合后释放到细胞外基质的膜性囊泡,其直径在50 ～ 150 nm,电镜下呈凹半球状。外泌体由几乎所有器官来源的正常细胞和肿瘤细胞产生,并且半衰期长,可以稳定存在于几乎所有的生物体液中。其脂质双分子层结构可以有效保护内容物穿过血-脑屏障等生物屏障而不被体液中的酶类降解。膜内可以携带其来源细胞的遗传物质如RNA、DNA、mRNA、microRNA,还含有蛋白质、脂类和代谢物等[9]。与病毒和非病毒递送系统相比,外泌体具有包装容量大、生物相容性、非免疫原性和先天跨过包括屏障生物膜的能力等优点,能够更好地在细胞间传递遗传物质和蛋白质等成分,促进细胞间的通信和信息传递[10,11]。机体微环境导致外泌体的异质性,改变外泌体数量及大小、内容物含量及功能,不同细胞来源的外泌体差异很大。研究表明,外泌体的生物发生有两种方式:一是通过质膜或跨高尔基体网的内出芽,形成早期内体并成熟为晚期内体,最后成为细胞内多囊体。转运到细胞膜后,多囊体与质膜融合导致外泌体释放到细胞外。另一种机制是质膜重排导致微囊泡从细胞膜上出芽。根据来源不同,外泌体可参与生理或病理生理过程并发挥着不同的作用。例如,抗凋亡[12,13]、抗纤维化[14～16]、促血管生成[17,18]和免疫调节[19,20]作用。

2 外泌体作为内耳递送载体

外泌体通过转移蛋白质、核酸和代谢物等内容物介导细胞间通讯可能存在多种机制。不同来源的外泌体优先与特定类型的细胞特异性结合。这种特异性识别大部分是通过外泌体膜蛋白与靶细胞表面特异性受体识别并特异性结合,激活细胞内信号;或者外泌体膜蛋白可被细胞外的蛋白酶切割。切割后的片段可以作为可溶性配体与靶细胞表面受体结合,这一机制反过来激活靶细胞内的信号级联反应;抑或外泌体与靶细胞膜融合,以非选择性的方式释放其内容物于受体靶细胞内[21]。

腺相关病毒(adeno-associated virus, AAV)载体是目前直接体内基因治疗的主力,但AAV载体作为有效的基因转移载体穿过体内生物屏障仍然存在障碍,如内耳血-迷路屏障;同时存在转基因大小容量(～4.7 kb)限制问题,许多基因超过了AAV载体的包装能力。有研究利用外泌体相关AAV (Exo-AAV)将基因高效递送至内耳,用于听力和平衡障碍的基因治疗。证明了Exo-AAV与传统AAV载体相比,在抗AAV抗体逃避和向新生小鼠内耳毛细胞递送基因的性能等方面更具有优势,提高了不易被传统AAV有效转导的内毛细胞和外毛细胞的基因转移率。即使存在抗AAV抗体,Exo-AAV转导细胞的能力也显著增强。并且观察到外泌体内和外泌体表面有多个衣壳,可以将不同的AAV载体衣壳包装到同一外泌体中,提高多组分载体系统的效率[10,11]。

3 外泌体作为内耳疾病生物标志物

迄今为止,临床上仍然没有一种手段进行内耳组织活检或血液检测以确定病理来源、诊断SNHL的亚型,也使我们无法理解听力损失的主动过程,限制了内耳疾病靶向治疗的发展,突出了开发内耳疾病相关生物标志物的必要性[22,23]。因为内耳位置深在且结构复杂,直到2018年,才首次报道内耳来源的外泌体[24],研究者发现大鼠原代培养的内耳细胞释放的外泌体有可能被用作反映内耳状态的生物标志物。随后,对出生后不同发育阶段的耳蜗组织进行外泌体含量分析发现,外泌体具有与内耳和听觉神经系统发育相关的特异性miRNA和蛋白质组图谱[25]。2021年,有研究者首次利用人外淋巴液分离出携带毛细胞特异性蛋白的外泌体[22],不仅证明了外泌体在内耳外淋巴液中的存在,也提示毛细胞是外泌体的潜在来源。尽管该研究提示外泌体可能参与内耳发育,但外泌体在成人内耳中是否存在和作用机制尚不清楚。

目前已有多项研究表明,当经历各种应激源和病理改变时,外泌体的水平同时也会波动,包括继发于耳毒性药物的SNHL,如顺铂诱导的细胞毒性[24,26,27]和氨基糖苷类抗生素诱导的细胞毒性[28]所在组的外泌体蛋白水平和颗粒浓度都有所降低。其中一篇报道进一步对顺铂处理小鼠分离的外泌体进行了蛋白质组学的分析,检测到外泌体中特异性表达的蛋白质以及内耳标记物,同时发现一些与SNHL相关的蛋白质,如Tmem 33、Pgm1、Cct8等蛋白也具有显著变化[24]。包裹在外泌体中的 microRNA结构稳定,是血浆中组织损伤的敏感生物标志物,目前众多研究正试图利用各种体液中的 microRNA对疾病进行诊断和预后评估。外淋巴液的miRNA表达谱可能与听力损失的程度相关,有望在细胞和分子水平上深入了解不同内耳病理学中发生的情况[23,29,30]。

4 外泌体用于SNHL治疗的潜能

获得性SNHL的主要病理因素包括内耳缺血、缺氧、老化、噪声、耳毒性药物等,通过诱导细胞内信号通路、细胞器应激与炎症相互作用,增加活性氧(reactive oxygen species,ROS)生成并抑制耳蜗内抗氧化防御系统来破坏细胞氧化还原稳态,最终导致毛细胞凋亡或坏死[26,31]。研究表明,外泌体可以清除细胞内过多的ROS,递送线粒体保护蛋白,从而提高细胞的抗氧化能力,增强细胞活力[32]。

4.1 外泌体对于耳蜗毛细胞损伤的保护和听力修复作用小鼠内耳干细胞来源的外泌体通过将miR-182-5p递送到庆大霉素处理的小鼠耳蜗毛细胞系细胞,调节miR-182-5p / FOXO3轴,从而改善氧化还原环境和防御氧化应激,发挥其细胞保护和抗炎的作用,保护耳蜗毛细胞对抗庆大霉素诱导的氧化应激[33]。脐带间充质基质干细胞(umbilical cord mesenchymal stromal cell,UC-MSC)来源外泌体可通过降低肿瘤坏死因子-α(tumour necrosis factor -α,TNF -α)和白细胞介素-1β(interleukin-1β,IL-1β)的表达,上调神经生长因子,发挥抗炎作用,保护外毛细胞修复听力损失[34]。有研究进一步发现,与一般处理的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell,BMSC)来源外泌体相比,缺氧预处理BMSC来源外泌体组缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α,HIF-1α)、超氧化物歧化酶1(superoxide dismutase 1,SOD1)表达上调。HIF-1α可用于缓解顺铂诱导的耳毒性,增加听觉敏感性,减少毛细胞丢失,降低氧化应激;SOD1可以降解ROS,降低顺铂诱导的耳毒性,避免毛细胞和螺旋神经节神经元的损害[27]。MicroRNA-21过表达的神经前体细胞(neural progenitor cell,NPC)来源的外泌体通过将miR-21递送至巨噬细胞以调节炎症细胞因子的转录,抑制耳蜗内的炎症过程来预防小鼠缺血再灌注损伤引起的听力损失[35]。有研究发现,热休克时,内耳椭圆囊释放携带热休克蛋白70(heat shock 70-kDa protein,HSP70)的外泌体,与毛细胞上的TLR4受体结合,对暴露于新霉素的毛细胞起到一定的保护作用,抑制或耗竭携带HSP70的外泌体则失去了热休克的保护作用[28]。说明HSP70可能是外泌体发挥保护作用的介质之一,这一机制强调了外泌体在氨基糖苷类抗生素致聋环境中的潜在治疗用途。随后研究发现,MSC与耳蜗外植体共培养导致外泌体中HSP70含量增加,并且能够保护外植体免受顺铂诱导的毒性[36]。此外,热休克预处理BMSC后衍生的外泌体HSP70降低了顺铂暴露后小鼠内耳中促炎细胞因子IL-1β、IL-6和TNF-α的浓度,增加了抗炎细胞因子IL-10的浓度[37],减轻了顺铂的耳毒性。

4.2 外泌体对于耳蜗螺旋神经节神经元损伤的保护作用外泌体对于听觉神经元即螺旋神经节神经元也具有保护作用。在体外,MSC来源外泌体对T细胞和小胶质细胞具有免疫调节活性;同时,与目前效果最好的神经保护因子BDNF相比, MSC来源外泌体显著提高了离体螺旋神经节神经元的存活率,显示出强大的保护作用和神经再生能力[38]。而在体内实验中,局部应用MSC 来源的外泌体于内耳可显著减轻听力损失,并保护听毛细胞免受噪声诱导的体内创伤[38]。最新研究发现,位于螺旋神经节区域的微血管的周细胞释放含有血管内皮生长因子-A (VEGF-A )的外泌体,VEGF-A与VEGFR2 ( Flk1 )结合表达于受体细胞,包括内皮细胞和螺旋神经节神经元,控制血管和神经元的生长[39]。以人工耳蜗为基础的电刺激可能是诱发人工耳蜗植入术后残余听力损失的重要原因[40]。此外,人工耳蜗植入后产生早期和慢性炎症反应,促使电极阵列周围耳蜗内纤维化组织沉积以及听觉毛细胞和螺旋神经节神经元的丢失,这也会损害电极阻抗和植入后的听力结果[40,41]。目前,首例人类病例报告了在耳蜗植入过程中局部应用同种异体人UC-MSC来源外泌体以减少电极插入引起的炎症。术后5天内及随访24个月以上,未见发热、过敏等急性全身或局部毒性反应。最重要的是,语音清晰度在第一年内得到改善,并在植入后的第二年保持不变[42]。此报告的主要缺点是来自单一患者治疗的经验,不足以进行关于安全性、效价或有效性的全面评估。

综上,外泌体具有用于临床诊治的潜力,包括作为高效且安全的递送载体的潜力、作为生物标志物检测各体液中特定蛋白或miRNA的潜力、作为具有强大的抗炎抗氧化作用的内耳治疗剂的潜力。外泌体的检测及其蛋白质谱的变化可能对耳科病理,特别是内耳的治疗很有帮助;也可以通过外泌体监测耳毒性药物继发的内耳损伤;或用于突发性SHNL患者,以帮助指导临床治疗。目前对不同内耳疾病的分子病理生理机制缺乏全面的认识,了解导致内耳损伤并诱发听力损失的确切分子机制将加速有效精准治疗的发展。尽管外泌体作为内耳治剂的潜在用途是充满希望的,但这一领域还需要进一步的深入研究。