内耳类器官技术的研究进展

古兴亮,林昭锦,齐洁玉,柴人杰,3,4,5,6

(1.东南大学数字医学全国重点实验室,附属中大医院耳鼻咽喉头颈外科,生命科学与技术学院,生命健康高等研究院,江苏省生物医药高新技术研究重点实验室,江苏 南京 210096;2.华南理工大学生物科学与工程学院,广东 广州 510000;3.南通大学神经再生协同创新中心,江苏 南通 226001;4.四川省医学科学院·四川省人民医院耳鼻咽喉头颈外科,四川 成都 610072;5.中国科学院干细胞与再生医学研究中心,北京 100101;6.首都医科大学北京市神经再生修复研究重点实验室,北京 100069)

听力损伤作为危害人类健康前三名的疾病,在全世界范围内有近五分之一的人被其困扰。 由于成年哺乳动物毛细胞损伤或丢失后的不可再生性,研究和揭露听力损伤相关的机制并制定干预策略对全人类有着非比寻常的意义。内耳是感知声音和平衡的器官。全世界超过6%的人患有听力损失,同样有6%的人患有平衡障碍。虽然内耳疾病常见,但干预和恢复其感觉和平衡功能的方法有限。听力损失致病机制研究和开发治疗干预措施需要明确控制组织发育、存活的信号通路的基础知识,并建立基于人类细胞的治疗策略。内耳的体外模型,如类器官系统,可以帮助识别新的保护或再生药物,以及开发新的基因疗法。

1 内耳

2019年全球有15.7亿人被听力损伤所困扰,约占总人口五分之一,在“全球疾病负担”分析中,危害健康的伤残损伤的病因前三名为腰痛、偏头痛和听力障碍。大多数永久性听力缺失都是感音神经型的[1]。人耳可以大致分为外耳、中耳和内耳三部分[2],其中内耳包含听觉感受器和方位感受器,内耳的机械感受器主要由感觉毛细胞和支持细胞组成[3]。感觉毛细胞能够将机械刺激转化为电化学信号,随后激活螺旋神经元(spiral ganglion neuron,SGNs)。前庭组织中的其他感觉斑块,包括椭圆囊、球囊和半规管的壶腹嵴,都含有感觉毛细胞,负责感知线性运动、重力和头部旋转,共同维持平衡感。耳蜗感觉上皮中存在两种类型的毛细胞,内毛细胞和外毛细胞,作为主要声音受体其作用是放大上皮中的声音诱导振动[4, 5]。在鸟类中,内耳毛细胞可以持续的更新[6～10],毛细胞的损伤可以激活病变区域支持细胞和毛细胞有丝分裂和分化[11, 12],从而恢复内耳功能[13, 14]。普遍认为哺乳动物毛细胞仅在胚胎发育过程中产生,成年哺乳动物内耳毛细胞损伤或丢失后将很难再生[3, 15～22]。

2 内耳类器官的构建与发展

类器官是指由胚胎干细胞(embryonic stem cells,ESCs)、诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cell, iPSC)、组织前体细胞或者成体细胞,在体外自组装形成的能部分模拟体内组织结构与功能的细胞聚合体[23, 24]。2009年Sato等首次成功地在体外培养出了真正意义上的肠道类器官[25],这种肠类器官体系的成功建立开启了类器官研究的新篇章。近几十年,随着体外干细胞培养技术的进步以及人们对细胞外基质的深入理解,不同组织器官的类器官培养系统逐步受到重视并被建立和优化。目前,已经建立了包括脑、肾脏、肺、肠等在内的多种类器官培养技术[26]。类器官技术的快速发展在疾病发生发展机制的研究[27]、建立新的药物筛选方案[23]以及治疗策略[28]等诸多方面都发挥了极其重要的作用。

目前的内耳类器官衍生方案大多为在早期诱导期间操纵转化生长因子β (transforming growth factor,TGFβ),骨形态发生蛋白 (bone morphogenetic protein, BMP) 和成纤维细胞生长因子 (fibroblast growth factor, FGF),在分化后期激活Wnt信号通路来促进耳基板形成[29～31]。2010年Oshima等首次证明了功能性内耳毛细胞可以衍生自ESC和iPSCs[32]。2014年Karl等首次描述了一种利用三维 (3D) 小鼠胚胎干细胞培养物生成内耳类器官的培养系统,提供了一种体外可重复、可扩展生成内耳感觉组织的方法。其中内耳感觉组织在一定的生化条件下由小鼠胚胎干细胞产生,该模型适用于内耳生物学和再生的基础和转化研究[29]。2016年Mills等描述了一种用于产生内耳感觉上皮的3D培养方法,生成感觉毛细胞的同时还生成了神经元群[33]。之后Koehler等给出了一种将人类多能干细胞分化为含有功能性毛细胞的内耳类器官的方法。Koehler等使用3D培养系统,通过调节TGF、BMP、FGF和Wnt信号,诱导单个干细胞聚集体产生多耳囊泡结构。同时使用CRISPR / Cas9,生成了ATOH1-P2A-eGFP细胞系来检测诱导衍生毛细胞的效果,并证明衍生的毛细胞具有类似于天然感觉毛细胞的电生理特性。该培养系统将有助于阐明人类内耳发育的机制和测试潜在的内耳疾病相关疗法[30]。Nie等发表了一种体外3D分化方法,将人多能干细胞(human pluripotent stem cell, hPSCs)聚集在低结合的96孔板中,并用细胞外基质蛋白处理从而促进其上皮化。用逐步调节BMP、FGF和Wnt等信号通路的小分子以及使用重组蛋白处理类器官,有顺序地诱导非神经外胚层、耳-鳃外胚层区和耳基板的形成。耳基板随后经历自我引导的形态发生并形成耳囊泡,最终产生含有内耳毛细胞和支持细胞的感觉上皮组织,以及与毛细胞有突触连接的神经元。这些hPSCs来源的内耳感觉结构被认定为人类内耳类器官[34]。Kurihara等提出了一种高效的将人iPSCs分化为含有SGNs样细胞的内耳类器官的方案,并在内耳类器官的表面鉴定出与SGNs基因表达模式相似的神经元细胞。这些细胞表现出神经元特异性的电压和时间依赖性的电流特性,类似于在啮齿动物SGNs中看到的两种不同放电模式[35]。Liu等在3D培养系统中诱导小鼠胚胎干细胞产生机械敏感毛细胞,发现类器官毛细胞的机械敏感性相当于正常小鼠功能成熟的毛细胞,并拥有类似的离子通道表达动态发育过程,和天然前庭毛细胞相似[36]。Osaki 等开发以一种诱导前庭毛细胞分化的类器官培养体系,使用前庭细胞来源的限定培养基会增强前庭毛细胞相关标志物(Math1, Myosin6, Brn3c, Dnah5)的表达,但未增强耳蜗毛细胞相关标志物Lmod3的表达[37]。

3 内耳类器官的应用

3.1 模拟发育内耳类器官可用于研究早期耳板诱导,评估毛细胞和内耳感觉神经元发育,以及毛细胞与感觉神经元之间的突触发生。进一步揭示了人类内耳毛细胞再生的机制,使类器官成为研究内耳遗传疾病和干细胞疗法的重要工具[30]。内耳类器官的3D培养系统可以产生大量功能齐全的感觉细胞,可用于研究内耳发育和疾病的机制以及内耳修复的再生机制[36]。内耳类器官模型也是首次提供验证基于药物的疗法、基因靶向方法和细胞替代疗法的内耳工具[38]。Nie 等使用人类多能干细胞衍生的类器官作为模型系统研究CHD7突变如何影响内耳发育,CHD7在调节人类耳系规格和毛细胞分化中起着关键作用。该研究结果揭示了与CHARGE综合征相关的内耳表型的分子基础,提供了潜在的治疗靶基因和途径[39]。

目前对人类耳聋的细胞和分子生物学以及更广泛的人类听觉系统的大部分理解都是从动物模型的观察和实验研究中推断出来的。由于无法在不对听力或平衡器官造成重大、不可逆转损害的情况下进行人体活检,因此通常对人类内耳细胞的生物学研究仅限于稀少的胎儿或尸体组织。利用内耳类器官模拟遗传性耳聋,对开发新的治疗方法,如生长因子、干细胞和基因疗法有着非比寻常的意义,同时也是非常好的临床前测试高保真模型[1]。

3.2 致聋机制研究此外,在类器官模型中应用基因靶向技术,可以敲除和敲入基因以研究不同基因对内耳毛细胞分化与发育的作用[40, 41]。Cong等设计了两种不同的II型CRISPR / Cas9系统,具有简单可编程性和广泛适用性,利用短RNA指导Cas9核酸酶精确切割人类和小鼠细胞中内源性基因组位点,将多个引导序列编码到单个CRISPR阵列中,可以实现哺乳动物基因组多位点同时编辑[42]。利用类器官和基因编辑技术可以很好的构建不同的基因缺陷型耳聋模型,一般是从遗传性耳聋患者身上收获体细胞,通常是真皮成纤维细胞或外周血单核细胞,并将其转化为iPSC,可以形成具有不同遗传缺陷的细胞系[43]。

3.3 耳聋治疗研究此外还可以建立一个强大的高通量耳蜗类器官平台,促进人工耳蜗祖细胞的3D扩增和毛细胞的时间调节分化。Liu 等对FDA批准的药物库进行高通量筛选,将VEGFR抑制剂瑞戈非尼确定为用于毛细胞分化的强效小分子,该研究不仅证明了耳蜗类器官平台在毛细胞生理学高通量分析中的能力,而且还强调了VEGFR-MEK-TGFB1信号串扰作为毛细胞再生和听力恢复的潜在靶标[44]。Kurihara 等证明内耳类器官具有用作药物诱导神经病变实验模型的潜力,以及为将来开发听力缺失的新治疗方法提供帮助[30]。内耳类器官为内耳发育和病理发生观察提供了优秀体外模型,在寻找新疗法的过程中,加速治疗药物的发现。内耳类器官还可用于测试病毒介导的先天性听力损失障碍基因疗法[44, 45],并筛选耳毒性药物暴露后再生感觉毛细胞的小分子化合物[46]。

4 总结与展望

内耳作为重要的感觉器官之一, 对其的研究从未停止过。内耳类器官在内耳研究邻域发挥了重要的作用,也极大地推进了内耳器官的研究进展。同样,对内耳类器官诱导构建的研究从未停止过。异质性是部分3D培养系统的优势同时也是局限性。与单层培养模式不同,类器官中的细胞根据其在类器官中的空间位置接收不同浓度的信号线索,常导致位于类器官不同深度的细胞不同步分化,表层中的细胞分化得更快。此外,内耳内器官仅产生前庭感觉器官样结构。未来仍需要对协同调控策略进行进一步修改,开发耳蜗细胞类型的诱导和分化新方法,包括如何衍生出耳蜗型毛细胞样细胞,新生毛细胞是否存在细胞与细胞间连接,以及内耳类器官是否容易受到导致人类和其他哺乳动物耳聋的相同外在损伤,以及如何在体外再现调控内耳的血液供应的脉管系统。