基于焦磷酸测序的CYP2C19*2、CYP2C19*3基因分型方法性能验证*

张婕妤，初亚男，李玉娇，封利颖

东部战区总医院临床药学科，江苏南京 210002

药物基因组学是一门研究与药物吸收、代谢和转运相关的遗传因素如何影响药物治疗效果或不良反应的学科[1-3]。细胞色素P450 2C19(CYP2C19)是细胞色素P450超家族的一种同工酶，参与约2%的药物代谢过程[4-5]。CYP2C19拥有的多种基因多态性表现为不同的酶活性，其中CYP2C19*2和CYP2C19*3的多态性与氯吡格雷抵抗、质子泵抑制剂的疗效相关[6-7]。临床药物基因组学实施联盟(CPIC)、荷兰药物遗传学工作组(DPWG)和加拿大药物基因组学药品安全网(CPNDS)均建议临床在使用氯吡格雷和质子泵抑制剂等药物前检测CYP2C19基因型[8-9]。根据《医学实验室质量和能力认可准则(IS015189:2012.IDT) :CNA5-CL02》和江苏省临床检验中心对临床基因扩增检验实验室的要求[10-11]，任何一项用于常规检测的项目在引入临床使用前必须通过性能验证。定性检测的性能指标包括最低检测浓度、准确度、特异度和重复性/精密度等。本文旨在对实验室自建焦磷酸测序检测CYP2C19*2(rs424485,c.681G>A)和CYP2C19*3(rs4986893,c.636G>A)单核苷酸多态性的方法进行性能验证，保证其检测结果的准确、稳定及可靠。

1 资料与方法

1.1一般资料 选取2020年9月至2022年5月在东部战区总医院进行CYP2C19*2、CYP2C19*3单核苷酸多态性检测的乙二胺四乙酸抗凝全血标本作为研究对象。

1.2仪器与试剂 Wizard®基因组DNA提取试剂盒(美国Promega公司)；TaKaRa TaqTM(日本TaKaRa公司)；PyroMark Gold Q96 Reagents、Annealing buffer和Binding buffer(德国QIAGEN公司)；Streptavidin SepharoseTMHigh Performance(美国GE Healthcare Life Sciences公司)；屈臣氏蒸馏水。Q24焦磷酸测序仪(德国QIAGEN公司)；A200基因扩增仪(杭州朗基科学仪器有限公司)；微量紫外分光光度计(南京伍义科技有限公司)；VORTEX-GENIE 2涡漩混匀器(美国Scientific Industries基因公司)；Legand Micro 21R冷冻离心机(美国Thermo Fisher Scientific公司)。所有引物由上海英骏生物技术有限公司合成，引物序列见表1。

表1 检测CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的引物序列

1.3方法

1.3.1基因组DNA(gDNA)提取 根据DNA提取试剂盒说明书提取血液标本中的gDNA。选取浓度≥30 ng/μL，A260/A280在1.8～2.0的gDNA标本储存在-30 ℃冰箱中备用。

1.3.2PCR扩增 反应体系为50 μL，包括10×PCR Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTP 4 μL，25 mmol/L MgCl23 μL，5 U Taq酶0.25 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，gDNA 1 μL，蒸馏水补全总体系至50 μL。扩增程序：94 ℃ 5 min；扩增35个循环(94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s)；72 ℃ 7 min。

1.3.3焦磷酸测序 取20 μL PCR产物、2 μL Sepharose、18 μL蒸馏水、40 μL Binding buffer振荡混匀8 min，再制备单链至已加入1 μL 10 μmol/L的测序引物和24 μL Annealing buffer的24孔板中，80 ℃孵育30 s，室温放置1 min。CYP2C19*2位点核苷酸推注顺序为CCTTGA,CYP2C19*3位点核苷酸推注顺序为GGAATC。检测结果可由仪器分析后自动判读，也可根据信号峰的比值来判断。

1.3.4最低检测浓度验证 随机挑选CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型分别为*1*2型和*1*3型的gDNA标本各1份，用DNA Rehydration Buffer梯度稀释成10.0、2.0、0.4 ng/μL，每个浓度梯度设置3个复孔。

1.3.5准确度验证 随机选取20份临床gDNA标本进行焦磷酸测序，并将扩增产物送至深圳市华大科技有限公司进行双向Sanger测序验证。

1.3.7特异度验证 选取经焦磷酸测序验证CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型均为*1*1型(野生型)的gDNA标本各10份，将其扩增产物送至深圳市华大科技有限公司进行双向Sanger测序。

1.3.8临床标本检测 对2021年1月至2022年5月本院临床科室申请进行CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性检测的144份血液标本进行焦磷酸测序。

1.4统计学处理 采用SPSS17.0软件进行数据分析。计数资料以例数或百分率表示，Hardy-Weinberg平衡验证采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1最低检测浓度 由于杂合型标本的荧光强度只有野生型或突变型标本的一半，因此选择CYP2C19*2和CYP2C19*3位点的杂合型标本进行检测更能反映最低检测浓度。不同浓度标本的焦磷酸测序结果与稀释前结果比对一致，焦磷酸测序仪可分析浓度低至0.4 ng/μL的gDNA标本，故该方法的最低检测浓度为0.4 ng/μL。

2.2准确度 20份临床gDNA标本进行焦磷酸测序，分别检测出9份CYP2C19*2*1*1型，10份CYP2C19*2*1*2型，1份CYP2C19*2*2*2型；19份CYP2C19*3*1*1型，1份CYP2C19*3*1*3型，未检测出CYP2C19*3*3*3型。与Sanger测序验证结果比对，两种检测方法结果完全符合(图1)，焦磷酸测序方法准确度为100%。

注：A为CYP2C19*2*1*1型测序结果；B为CYP2C19*2*1*2型测序结果；C为CYP2C19*2*2*2型测序结果；D为CYP2C19*3*1*1型测序结果；E为CYP2C19*3*1*3型测序结果。

2.3特异度 10份CYP2C19*2和10份CYP2C19*3基因型均为野生型的gDNA标本，对其扩增产物进行双向Sanger测序均未检出突变型，检测特异度为100%。

2.4重复性 CYP2C19*2*1*2型gDNA标本的两个等位基因C和T的荧光信号值CV分别为4.20%和4.40%，CYP2C19*3*1*3型gDNA标本的两个等位基因A和G的荧光信号值CV分别为3.75%和3.21%，均<5%，重复性验证符合要求，见表2。

表2 CYP2C19*2*1*2和CYP2C19*3*1*3型重复性验证结果

2.5临床标本检测 144份临床标本的焦磷酸测序结果显示，CYP2C19*2多态性位点*1*1型(野生型)71份(49.3%)，*1*2型(杂合型)59份(41.0%)，*2*2型(突变型)14份(9.7%)；CYP2C19*3多态性位点*1*1型(野生型)139份(96.5%)，*1*3型(杂合型)5份(3.5%)，未检出*3*3型(突变型)标本(在中国人群中分布频率极低)，分布情况符合Hardy-Weinberg平衡定律(P>0.05)。

3 讨 论

药物基因组学结合了药理学和基因组学，主要用于探索有效、安全的药物和使用剂量，在精准医学中有着重要的意义[12-14]。药物基因组学的检测可用于指导医师采取更好的治疗决策，根据人体的基因型精准选择药物及剂量[15]。CYP2C19是CYP2C酶体系的一员，其基因多态性可导致酶活性的差异[16]。CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性是中国人群中常见的突变，分别会导致酶活性丧失和形成无活性的酶蛋白[17]。对于携带两个CYP2C19*2和CYP2C19*3功能缺失性等位基因的患者，如果常规使用氯吡格雷，发生心血管事件的风险将明显增加，因此治疗前应进行CYP2C19基因型检测，以减少不良事件发生风险[18-19]。奥美拉唑经CYP2C19代谢形成无活性的代谢产物，不同的CYP2C19*2和CYP2C19*3基因型会造成不同的人体血药浓度，进而形成抑酸疗效上的差异，因此需要针对基因型进行剂量调整[20]。

目前，检测CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的一些方法已通过性能验证，但关于焦磷酸测序的方法学验证报道少见。因此，本研究根据江苏省临床检验中心对扩增实验室的要求和医学界普遍执行的关于医学实验室能力要求的标准ISO15189，设计了4个方面的性能验证。经验证，本研究采用焦磷酸测序检测CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的最低检测浓度为0.4 ng/μL；采用Sanger测序为参考方法，两种方法测序结果完全符合，准确度为100%；特异度验证中真阴性野生型标本均未检出阳性突变，特异度良好；批内重复检测4次结果稳定。上述结果提示该方法性能指标符合药物基因组学检测项目的要求，符合临床基因扩增检验实验室检测质量要求。

综上所述，本文建立的基于焦磷酸测序检测CYP2C19*2和CYP2C19*3单核苷酸多态性的方法准确、稳定、灵敏度高，能为临床提供可靠结果，进而为临床使用氯吡格雷、质子泵抑制剂和抗抑郁药等提供个体化指导。