Th1/Th2、CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4在桥本甲状腺炎患者外周血中的表达及与甲状腺相关实验室指标的相关性*

罗百文，李茂城，杨丽梅

广东省惠州市中心人民医院检验科，广东惠州 516001

桥本甲状腺炎(HT)作为一种自身免疫性疾病，其主要病理特征为甲状腺存在大量淋巴细胞浸润，因此其也是公认的器官特异性免疫疾病，可严重影响患者的生活质量。研究认为，HT与遗传因素及患者自身免疫相关因素关系密切[1]。有研究显示，HT的发病机制与辅助性T淋巴细胞(Th细胞)失衡等所致的免疫失衡存在明显关系，主要表现为Th1细胞相关免疫反应上调，而Th2细胞相关免疫反应的作用尚不明确[2]。CD28、可诱导共刺激分子 (ICOS)、程序性死亡受体1(PD-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)等共信号因子在调节机体内T淋巴细胞的活化、增殖、自我识别和免疫耐受，以及免疫介导的组织损伤中发挥了重要作用，可能在HT发病机制中和Th1细胞与Th2细胞比值(Th1/Th2)失衡有关，但仍然有待深入研究。本研究收集了2021年在本院门诊或住院治疗的HT患者和部分健康体检者的外周血标本，通过检测相关指标，研究HT患者外周血中CD3+CD4+T淋巴细胞表面的共信号分子(CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4)与Th1、Th2细胞相关细胞因子[γ干扰素(IFN-γ)、白细胞介素(IL)-2、IL-4和IL-10]的表达情况，分析HT患者甲状腺相关实验室指标[甲状腺过氧化物酶抗体(TPOAb)、促甲状腺激素(TSH)、游离甲状腺素(FT4)及游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)]水平与IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4 水平是否存在相关性，现将研究结果报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 收集2021年在本院门诊或住院治疗的HT患者40例为HT组，另选择同期健康体检者40例为对照组。HT组男11例、女29例，年龄(45.0±8.3)岁；对照组男13例、女27例，年龄(43.9±9.2)岁。两组研究对象性别和年龄比较，差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。HT组纳入标准：(1)TSH、FT4及FT3等实验室指标检测提示甲状腺功能低下；(2)血清TPOAb和抗甲状腺球蛋白抗体检测结果为阳性；(3)甲状腺腺体弥漫性肿大或缩小，质地较韧；(4)超声检查提示甲状腺腺体回声减弱或紊乱，小片状低回声或伴有条索状强回声改变；符合(1)～(4)中两项或以上，或病理学检查提示慢性淋巴细胞性甲状腺炎即纳入研究。对照组纳入标准：(1)超声检查提示甲状腺腺体大小和质地正常；(2)甲状腺自身免疫抗体检测结果为阴性；(3)TSH、FT3和FT4等实验室指标检测提示甲状腺功能正常。两组排除标准：(1)近1年进行过放射性碘治疗；(2)患有类风湿关节炎、系统性红斑狼疮和多发性硬化等自身免疫性疾病；(3)患有传染性疾病；(4)合并导致肝功能不全、心功能不全、肾功能不全的系统性慢性疾病；(5)正在服用抗甲状腺药物或进行甲状腺激素替代治疗。本研究已通过本院医学伦理委员会审查，入组研究对象均自愿参加本研究，并签署知情同意书。

1.2方法

1.2.1血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平检测 采集所有纳入的HT患者和健康体检者外周血5 mL，室温静置后离心分离血清，将血清标本保存于-70 ℃冰箱待检。采用贝克曼库尔特公司生产的全自动化学发光免疫分析仪及配套试剂进行检测，所有操作均严格按照说明书要求完成。

1.2.2血清IFN-γ、 IL-2、IL-4和 IL-10水平检测 将上述保存的血清标本采用酶联免疫吸附试验检测IFN-γ、IL-2、IL-4和IL-10水平。

1.2.3流式细胞仪检测外周血中Th1、Th2细胞 (1)标本采集：按照标准方法采用肝素钠抗凝真空采血管采集研究对象外周血2 mL，保存于4 ℃冰箱，2 h内进行标本处理。(2)胞外染色：取300 μL抗凝血于无菌干燥离心管中并加入20 μL CD4-PC5单克隆抗体，振荡混匀后置于室温条件下避光孵育30 min，加入3 mL磷酸盐缓冲液(PBS)，离心弃去上清液。(3)细胞培养：分别加入935 μL RPMI 1640培养液、20 μL 2 μg/mL的Ionomycin工作液、10 μL 1 μg/mL的PMA工作液和35 μL 3.5 μg/mL的Monensin工作液，构成总体积为1 mL的细胞刺激培养体系。振荡混匀后置于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中孵育5 h后取出，加入3 mL PBS，离心弃去上清液；重复以上操作1次。(4)固定破膜：加入100 μL固定剂，振荡混匀后置于室温条件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，离心弃去上清液；然后加入l00 μL破膜剂振荡混匀后置于室温条件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，离心弃去上清液。(5)胞内染色：加入20 μL抗人IFN-γ-FITC单克隆抗体和 20 μL抗人IL-4-PE单克隆抗体后振荡混匀,对细胞内的细胞因子IFN-γ和IL-4进行特异性染色；置于室温条件下避光孵育20 min，加入3 mL PBS，离心弃去上清液。(6)上机检测：加入600 μL PBS重悬细胞，30 min内使用流式细胞仪进行检测，以CD4+IFN-γ+T淋巴细胞表示Th1细胞，以CD4+IL-4+T淋巴细胞表示Th2细胞，同时设置同型对照和阴性对照。

1.2.4流式细胞仪检测外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平 所有研究对象均于清晨空腹采集外周血标本2 mL，室温下乙二胺四乙酸抗凝，及时(6 h内)采用流式细胞仪检测。取4支流式管，依次标注CD28、ICOS、PD-1及CTLA-4，各管均加入CD3 APC 3 μL、CD4 PerCP 5 μL、CD8 FITC 5 μL，然后依次向各管加入CD28 PE、ICOS PE、PD-1 PE、CTLA-4 PE各5 μL，加入研究对象新鲜外周血标本50 μL。将所有流式管置于振荡器上轻微振荡后室温下避光孵育20 min。将各管取出，加入红细胞裂解液(每10 μL标本加入0.4～0.5 mL)。再次室温下避光孵育10 min后置于离心机内，1 200 r/min离心5 min，弃去上清液后置于振荡器上轻微振荡，各管加入PBS 1 mL。用流式细胞仪进行检测(每份标本至少收集 20 000个T淋巴细胞进行分析)，用流式细胞仪自带软件分析外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面所表达的CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平，其表达水平用其占CD3+CD4+T淋巴细胞的比例表示。

2 结 果

2.1两组血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平比较 HT组血清FT4和TPOAb水平均明显高于对照组，而FT3、TSH水平明显低于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 两组血清FT3、FT4、TSH及TPOAb水平比较

2.2两组外周血中Th1细胞、Th2细胞、Th1/Th2及相关细胞因子水平比较 HT组外周血中Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ和IL-2水平明显高于对照组，Th1/Th2也明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)。两组外周血中Th2细胞及其相关细胞因子IL-4和IL-10水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 两组外周血中Th1细胞、Th2细胞、Th1/Th2及相关细胞因子水平比较

2.3两组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平比较 HT组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、ICOS和PD-1水平明显高于对照组，差异有统计学意义(P<0.05)；两组CTLA-4水平比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 两组外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、ICOS、PD-1和CTLA-4水平比较

2.4HT患者各指标间相关性分析结果 FT4水平与Th1细胞、Th1/Th2水平呈正相关(P<0.05)；TSH水平与Th1细胞、Th1/Th2和IL-2水平呈负相关(P<0.05)；TPOAb水平与Th1细胞、Th1/Th2、IFN-γ、IL-2、CD28及ICOS水平呈正相关(P<0.05)；PD-1水平与Th1细胞、Th1/Th2、IFN-γ、CD28、ICOS水平呈正相关(P<0.05)；CD28及ICOS水平与Th1细胞、Th1/Th2、IFN-γ及IL-2水平呈正相关(P<0.05)；其余指标之间水平无相关性(P>0.05)，见表4。

表4 HT患者各指标间相关性分析结果(r)

3 讨 论

HT患者的甲状腺中大量浸润的T淋巴细胞主要包括Th细胞、细胞毒性T淋巴细胞(Tc)和调节性T淋巴细胞3种类型[3]。未致敏的Th细胞(Th0细胞)致敏后主要分化为以分泌IFN-γ和IL-2等为主的Th1细胞和以分泌IL-4和IL-10等为主的Th2细胞。其中Th1细胞及其分泌的细胞因子在细胞免疫效应过程中发挥重要作用，而Th2细胞及其分泌的细胞因子则在体液免疫效应过程中发挥重要作用，同时Th1细胞分泌的细胞因子会抑制Th2细胞的增殖，而Th2细胞分泌的细胞因子则会抑制Th1细胞的增殖。因此，Th1/Th2的动态平衡是机体内环境稳定的重要保证，其失衡是自身免疫性疾病、感染性疾病和肿瘤等多种疾病发生的重要原因，目前普遍认为HT也可能与Th1/Th2失衡有关。从本研究的结果来看，HT组Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ和IL-2水平较对照组明显升高(P<0.05)，而Th2细胞及其相关细胞因子IL-4和IL-10水平略低于对照组，但差异无统计学意义(P>0.05)，这进一步明确了Th1细胞及其相关细胞因子在HT发病机制中的重要作用，而Th2细胞及其相关细胞因子参与HT免疫应答反应的作用尚不明确，这与一些研究的结论相似[4-5]。

TPOAb是HT的自身特异性抗体，主要由微粒体合成，当其释放入血后与相应抗原结合，可激活补体并增强T淋巴细胞毒性，从而导致甲状腺功能损害加重，是造成甲状腺滤泡破坏的重要原因；同时TPOAb还可作为HT诊断和病情评估的特异性参考指标[6]。而FT4和TSH是诊断HT和评估HT患者甲状腺功能变化的重要指标。本研究中，FT4和TPOAb水平与Th1细胞、Th1/Th2水平呈正相关(P<0.05)，TSH水平与Th1细胞、Th1/Th2水平呈负相关(P<0.05)，此外，TPOAb水平与Th1细胞相关细胞因子IFN-γ和IL-2水平也呈正相关(P<0.05)，TSH水平与IL-2水平呈负相关(P<0.05)；而TPOAb、TSH、FT4水平均与Th2细胞及其相关细胞因子IL-4和IL-10水平无相关性(P>0.05)，更进一步明确了Th1细胞及其相关细胞因子与HT发病的密切关系。

有研究表明，激活的T淋巴细胞在自身免疫性疾病，如类风湿关节炎等疾病的慢性炎症过程中起重要作用[7]，而CD28和ICOS等表达的共刺激信号又是T淋巴细胞活化的关键因素[8]。因此，在一些自身免疫性疾病，如类风湿关节炎[9]、系统性红斑狼疮[10]等患者外周血单个核细胞中CD28、ICOS的表达上调。本研究中，HT患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28和ICOS水平较健康体检者也明显升高，与上述研究结论相似。Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ和IL-2等上调是自身免疫性疾病中慢性炎症发生的重要原因之一，本研究中，CD28和ICOS水平与Th1/Th2、Th1细胞、IFN-γ和IL-2水平呈正相关(P<0.05)，表明在HT的发病过程中CD28和ICOS可能促进了Th0细胞分化向Th1细胞偏移。另外，本研究中CD28和ICOS水平还与TPOAb水平呈正相关(P<0.05)，表明CD28和ICOS水平可能在HT的发病机制中发挥了重要作用，但具体机制还需要进行深入研究。

PD-1作为一种抑制性受体，主要表达于活化的T淋巴细胞、自然杀伤细胞、B淋巴细胞和单核细胞中[11]，目前发现其在类风湿关节炎[9]、系统性红斑狼疮[10]等自身免疫性疾病患者的T淋巴细胞表面也高表达，发挥着下调免疫反应的作用，是机体对自身炎症反应的一种负调节因子。本研究中，HT患者外周血CD3+CD4+T淋巴细胞表面PD-1水平较健康体检者明显升高，分析其机制可能为HT患者持续的 T淋巴细胞活化和过度产生的促炎细胞因子是免疫系统的危险信号，机体通过选择性上调负性共信号分子的表达而进行负反馈调节。CTLA-4是CD28的生理拮抗剂，与PD-1均属于共抑制分子，其主要功能为下调T淋巴细胞的免疫反应[12]。本研究中，CTLA-4水平在HT患者与健康体检者中比较，差异无统计学意义(P>0.05)，其可能原因为 CTLA-4在外周血中的表达水平相对较低，用流式细胞仪检测单个核细胞呈现出不敏感性。有研究显示，HT可能与CTLA-4基因多态性所导致的基因产物表达功能缺失有关，进而导致T淋巴细胞负调控出现障碍[13]。因此，要探明CTLA-4与HT的内在联系，还应该从甲状腺细胞的角度通过动物实验展开深入研究。

综上所述，HT患者外周血中Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ和IL-2水平较健康体检者均明显上调，其CD3+CD4+T淋巴细胞表面CD28、ICOS和PD-1的表达也均明显上调。因此，Th1细胞及其相关细胞因子IFN-γ和IL-2，以及CD28、ICOS和PD-1可能在HT的发病机制中发挥了重要作用。