IgA肾病患者血浆中miR-191-5p表达及其与肾间质纤维化相关性的研究

夏薇青， 宋菊香， 杨二梅， 曹义甫， 王天智， 刘翠红

(河北省石家庄市第三医院肾内科, 河北 石家庄 050000)

IgA肾病以IgA或IgA为主的免疫复合物在肾小球系膜沉积为特征的炎症性肾病，是全球最常见的原发性肾小球肾炎，也是慢性肾脏病(CKD)和肾功能衰竭的主要原因，随着病情进展可引起贫血、骨骼疾病、骨折以及心血管疾病等并发症，增加患者全因死亡风险[1]。肾间质纤维化(RIF)是慢性肾脏病向终末期肾功能衰竭发展的必经途径，其组织病理学特征是肾小管细胞凋亡、细胞外基质(ECM)成分在肾间质内过度沉积和肾间质成纤维细胞增殖[2]。目前临床在抗肾间质纤维化方面缺乏有效的治疗手段，仍以预防为主，探讨与肾间质纤维化相关的生物学标志物对临床早期诊治有着重要的意义。大量研究表明微小核糖核酸(miRNA)参与肾脏病理生理学调控，与RIF有着密切的关系[3]。已知炎症、氧化应激与RIF发病有关，氧化应激、炎性细胞浸润可促使肾间质肌成纤维细胞积累和纤维化，miR-191-5p可靶向氧化应激反应激酶1(OXSR1)抑制氧化应激反应和炎性细胞因子的产生，减轻肾细胞凋亡和肾损伤[4]。miR-191-5p是否与CKD患者RIF有关尚不清楚，本研究拟检测IgA肾病患者血浆中miR-191-5p表达，探讨其与RIF及其相关指标、肾功能之间的关系，以期为临床诊治提供参考。

1 资料与方法

1.1临床资料:选择2017年2月至2022年2月我院收治的80例IgA肾病患者(IgA肾病组)，男47例，女33例；年龄32～64岁，平均(47.18±11.63)岁。纳入标准：①符合《KDIGO 2012慢性肾脏疾病评估和管理临床实践指南》中IgA肾病的诊断标准[5]；②年龄18周岁以上；③入组前均行肾组织活检，病理资料完整。排除标准：①痛风或尿路结石；②肾良恶性肿瘤；③合并自身免疫疾病、感染性疾病。根据2012年KDOQI临床实践指南中分期标准[5]分为Ⅰ～Ⅱ期组(42例)、Ⅲ期组(38例)。根据牛津分型中TIL程度[6]将其分为三组：T0组(20例)，肾小管萎缩/间质纤维化程度<25%；T1组(39例)，肾小管萎缩/间质纤维化程度25%～50%；T2组(21例)，肾小管萎缩/间质纤维化程度>50%。另选择77例健康志愿者为对照组，男41例，女36例；年龄35～66岁，平均(47.92±11.24)岁。IgA肾病组和对照组基线资料比较差异无统计学意义(P>0.05)，本研究已经获得我院伦理委员会批准，受试者均签署同意书。

1.2方 法

1.2.1实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR):所有受试者在入组次日清晨禁食期间采集3mL外周静脉血，将血样置于含有EDTA的抗凝管中混匀，放入ScientificTM落地式超高速离心机(美国赛默飞公司)离心(相对离心力8500×g/5400rpm)离心取上层液(即血浆)检测。使用TRIzol®试剂(美国赛默飞Invitrogen)提取总RNA，RevertAidTMFirst Strand cDNA Synthesis kit(美国赛默飞)将RNA 逆转录为cDNA。使用 SYBR RT-PCR 试剂盒(中国大连Takara生物科技有限公司)在 StepOnePlusTM实时 荧光定量PCR系统(美国赛默飞Applied Biosystems)上进行三次重复qRT-PCR分析。使用比较循环阈值(2-ΔΔCt)的方法计算miR-191-5p相对表达水平。反应条件为:预变性95℃ 5min，然后是40个循环的95℃ 30s，95℃ 5s，60℃ 30s。反应体系，DNA模板2μL，上下游引物各1μL，Premix Ex Taq DNA 聚合酶25μL，RNase-Free ddH2O 21μL。引物序列，miR-191-5p，正向：5'-CGGAATCCCAAAAGCAGCTG-3'，反向：5'-TGTCGTGGAGTCGGCAATTG-3'；U6(内参)正向，5'-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3'和反向，5'-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-3'。

1.2.2肾功能和RIF指标:采用AU400全自动生化分析仪(日本Olympus公司)检测肾功能指标-血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)含量；采用HBS-1096A全自动酶标分析仪(南京德铁实验设备有限公司)运用酶联免疫吸附试验检测RIF指标-转化生长因子TGF-β1、TGF-α水平，试剂盒购自美国赛默飞公司。

1.2.3肾组织活检:IgA肾病患者入组前均行穿刺活检，取活检肾组织，采用4%多聚甲醛溶液中室温固定6～8h，全自动脱水，石蜡包埋，3μm切片。取石蜡包埋切片，脱蜡水化，PASM，Masson染色，立春红-品红着色10min，流水冲洗摇晃至干，1%磷钼酸盐水溶液分色5min，去除磷钼酸盐，苯胺蓝染色5min，水流冲洗，依次加入95%酒精、无水酒精和透明二甲苯，中性胶封片。送金域医学检验中心进行病理结果分析，每个病理切片取上、中、下、左、右等5个视野，于LV150N光学显微镜(日本尼康公司)观察和计算切片着色面积。

2 结 果

2.1IgA肾病组和对照组血浆miR-191-5p表达、肾功能以及RIF指标比较:IgA肾病组血浆miR-191-5p表达低于对照组(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于对照组(P<0.05)，见表1。

表1 IgA肾病组和对照组血浆miR-191-5p表达肾功能以及RIF指标差异

2.2不同CKD分期血浆miR-191-5p表达、肾功能以及RIF面积和指标比较:Ⅲ期组血浆miR-191-5p表达低于Ⅰ～Ⅱ期组(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于Ⅰ～Ⅱ期组(P<0.05)，RIF面积大于Ⅰ～Ⅱ期组(P<0.05)，见表2。

表2 不同CKD分期血浆miR-191-5p表达肾功能以及RIF面积和指标差异

2.3不同RIF分期血浆miR-191-5p表达、肾功能以及RIF面积和指标比较:T2组血浆miR-191-5p表达低于T0组和T1组(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于T0组和T1组(P<0.05)，RIF面积大于T0组和T1组(P<0.05)；T1组血浆miR-191-5p表达低于T0组(P<0.05)，Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α水平高于T0组(P<0.05)，RIF面积大于T0组(P<0.05)，见表3。

表3 不同RIF分期血浆miR-191-5p表达肾功能以及RIF面积和指标差异

2.4miR-191-5p表达与肾功能、RIF面积和指标的相关性:CKD患者血浆miR-191-5p表达与RIF面积、Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α均呈负相关(r=-0.509、-0.379、-0.311、-0.475、-0.486，P<0.05)。

3 讨 论

RIF是IgA肾病的病理标志及其进展为终末期肾功能衰竭的预测因子，其发病机制复杂，与肾小管上皮细胞表型转化、炎症细胞浸润、调控纤维化细胞因子激活、ECM转换失衡、氧化应激、慢性缺氧等多种因素有关。虽然早期RIF引起的肾脏损害是可逆的，但瘢痕形成期的RIF是不可逆的，积极探寻与RIF相关生物学指标对预防和延缓纤维化进展，抗RIF治疗和预后风险评估均具有重要意义。miRNA在基因表达调控和信号转导通路反馈回路中发挥着重要作用，参与细胞分化、增殖、凋亡、代谢、造血、身体形态发生等生理过程，越来越多证据表明miRNA失调可能与IgA肾病的发病机制和发展有关。

miR-191-5p是一种多功能的miRNA，属于miR-191家族，在内皮细胞中表达丰富，可靶向血管内皮锌指1抑制血管生成促进缺血性脑损伤，下调miR-191表达可增加可提高脑源性神经营养因子水平，改善异氟醚诱导的认知障碍，减缓神经元细胞凋亡。miR-191还可通过直接靶向Smad2，激活TGF-β信号通路，促使血管内皮细胞增殖，miR-191过表达将上调金属硫蛋白1E诱导基质金属蛋白酶表达和ECM重塑，参与主动脉瘤形成过程[7]。同样miR-191具有免疫调节作用，研究显示miR-191是幼稚、记忆和调节性T细胞稳态的关键调节因子，miR-191表达下调可减弱细胞内信号传导与转录活化因子5信号通路，导致外周CD4+调节性T细胞以及幼稚T细胞和记忆CD8+细胞数量减少[8]。miR-191通过靶向调节转录因子-叉头/翼状螺旋转录因子P1、E2A和早期生长反应因子1促使B细胞发育，miR-191表达缺失和异位表达将导致B系细胞发育停滞[9]。

miR-191异常表达与肾脏疾病有着密切关系，已有报道表明miR-191-5p在肾细胞癌中表达下调，miR-191-5p表达缺失可促使肾癌细胞增殖、迁移和侵袭，提示miR-191-5p在肾细胞癌中发挥肿瘤抑制基因作用[10]。而在肾缺血再灌注损伤中miR-191表达上调，通过靶向抑制胱硫醚β合酶表达，促进肾小管上皮细胞凋亡和肾缺血再灌注性损伤[11]。本研究发现IgA肾病组血浆miR-191-5p表达低于对照组，且随着分期增加而降低，miR-191-5p与Scr、BUN呈负相关，表明miR-191-5p表达缺失可能参与IgA肾病发病过程。Berillo等[12]报道同样显示高血压所致慢性肾病患者血浆miR-191-5p表达下调，miR-191-5p低表达与eGFR降低和中性粒细胞与淋巴细胞比率增加有关，提示miR-191-5p低表达可能通过促使炎症反应参与肾功能损害过程。目前miR-191-5p与RIF的关系尚不清楚，本研究发现IgA肾病患者血浆miR-191-5p表达在不同RIF分期中差异显著，随着RIF分期增加而下调，且与RIF面积、TGF-β1、TGF-α呈负相关，提示miR-191-5p表达缺乏可能引起RIF，进而促使CKD发病进程，推测可能的机制为：首先，炎症细胞浸润是促纤维化的主要途径，炎症信号通路的激活可引起核因子-κB活性增强，促使炎症介质合成、TGF-β和ECM蛋白分泌，导致成纤维细胞增殖和ECM成分沉积，引起RIF。miR-191-5p具有抗炎作用，研究显示miR-191-5p过表达可抑制NLRP3炎性体通路减轻炎症反应和炎症损伤[13]，由此可见，miR-191-5p表达缺失可能通过加剧炎症反应促使RIF进程。其次，活性氧的产生通过激活丝裂原活化蛋白激酶和Smad通路诱导TGF-β1，促使上皮间质转化和RIF，miR-191-5p具有抗氧化应激作用，通过特异性靶向OXSR1 mRNA抑制p38丝裂原活化蛋白激酶/核因子-κB信号通路激活，抑制氧化应激和炎症反应，因此miR-191-5p表达缺失可能加重氧化应激，诱导炎症反应，促使RIF发生和进展。

综上，IgA肾病患者血浆miR-191-5p表达降低，miR-191-5p低表达与RIF面积、Scr、BUN、TGF-β1、TGF-α增加有关，提示miR-191-5p缺乏可能与IgA肾病患者RIF以及肾功能下降有关，miR-191-5p可能通过促使RIF参与IgA肾病发病过程。本研究局限之处在于不能直接证实miR-191-5p与RIF间的关系，尚待进一步开展基础研究探讨。