酒精性脂肪肝小鼠肝组织蛋白表达谱检测及白藜芦醇干预作用机制的探讨

韩 敏易 旭游绍伟

(1.贵州中医药大学,贵阳 550025;2.贵州中医药大学第二附属医院,贵阳 550003)

酒精性脂肪肝(alcoholic fatty liver disease,AFLD)是酒精性肝病逐渐发展和治疗的关键病理前提[1-2]。尽管对酒精诱导脂肪肝的病理生理学进行了广泛的研究,但在过去50年中,除了禁酒以及对症处理和营养支持外,仍然没有针对性的治疗[3-4]。白藜芦醇是一种存在于红酒和葡萄的膳食多酚,研究显示在减轻酒精性和非酒精性肝功能障碍、胆汁淤积性肝损伤、化学性肝毒性、肝缺血再灌注等方面具有独特的药理活性[5-8]。Tang等[9]发现白藜芦醇处理减少了油酸和酒精作用后的HepG2细胞内脂滴形成。类似地,Tang等[10]、Kasdallah-Grissa等[11]、Chen等[12]和Ma等[13]发现,白藜芦醇除可能通过诱导自噬对酒精性脂肪肝变性具有保护作用外,膳食补充或服用白藜芦醇可降低酒精诱导的大鼠或C57BL/6J小鼠肝的氧化应激和凋亡,增加超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase, SOD)、过氧化氢酶(catalase, CAT)和谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase, GPx)等抗氧化酶活性,上调肝缺氧诱导因子-1α(hypoxia-inducible factor-1α, HIF-1α)蛋白表达,从而减少酒精性肝损伤。白藜芦醇也作为蛋白质去乙酰化酶SIRT1的激动剂,可以通过上调肝中SIRT1-AMPK信号系统阻止乙醇喂养小鼠酒精性脂肪肝的发生[14-18]。尽管白藜芦醇的有益作用已在各种酒精性肝病的动物和细胞模型中得到充分证实,但其具体作用分子机制仍不清楚。使用多种蛋白质质谱技术分别在一定程度上揭示了大鼠或小鼠肝组织在摄入不同程度酒精后的蛋白质表达变化[19-22]。遗憾的是,这些研究结果较零散,且对AFLD这一重要酒精性肝病病理初始阶段的肝蛋白质表达谱变化缺乏了解[23-24]。因此,本文运用4D非标定量蛋白质组学技术检测AFLD小鼠肝组织蛋白质表达情况,并由此探索白藜芦醇介导的抗AFLD干预作用机制。

1 材料和方法

1.1 实验动物

SPF级雄性C57BL/6J小鼠9只,8～10周龄,体重(22±2)g,由北京唯尚立德生物科技有限公司提供[SCXK(京)2021-0010]。饲养于贵州医科大学实验动物中心(北校区)带有IVC系统的饲养房内[SYXK(黔)2018-0001],20～23℃。实验前适应性喂养1周,自由进食SPF级鼠饲料和自由饮用灭菌自来水。实验过程严格遵守3R原则。动物实验由贵州中医药大学伦理委员会审批(20210093)。

1.2 主要试剂与仪器

BCA蛋白浓度测定试剂盒(中国碧云天公司,生产编号:P0011);胰蛋白酶(美国Promega,生产编号:V5117);乙腈(美国Thermofisher scientific,生产编号:204433);甲酸(美国Fluka,生产编号:A117-50);二硫苏糖醇(美国Sigma,生产编号:D9163-25G)。除盐柱(Phenomenex,货号:8B-S100-EBJ);NanoElute液相色谱仪、Tims TOF Pro飞行时间质谱仪(美国bruker)。

1.3 实验方法

1.3.1 药物制备

运用高压灭菌的30% koliphor HS15(BASF,30944788Q0)制备白藜芦醇(sigma,R5010)溶液。

1.3.2 动物分组与处理

小鼠分为对照组(C)、AFLD组(M)及白藜芦醇干预组(R),采用Lieber-DeCarli酒精液体饲料自由摄入+1次95%乙醇灌胃的NIAAA法制备小鼠AFLD模型和给予400 mg/kg白藜芦醇灌胃处理,具体方法见以往发表文章[25]。最后1次用药后24 h收集肝组织,以备蛋白组学检测分析用。

1.3.3 肝组织总蛋白质制备和胰蛋白酶水解

取适量-80℃保存的肝组织,用液氮研磨成粉末,加入40 μL体积含8 mol/L尿素、1%蛋白酶抑制剂、3 μmol/L去乙酰化酶抑制剂、50 mmol/L烟酰胺的裂解缓冲液,进行3次高强度超声裂解。4℃,12 000 r/min离心10 min后,收集上清液,蛋白质浓度用BCA法测定。取等量蛋白质样品和适量标准蛋白质混合物,加入终浓度为20% v/v的三氯乙酸,充分混合,4℃沉淀2 h。500 r/min离心5 min后,使用预冷丙酮洗涤和沉淀样品。在最终浓度为200 mmol/L的四乙基溴化铵溶液中进行超声分散,然后添加1/50比例的胰蛋白酶过夜处理,加入最终浓度为5 mmol/L的二硫苏糖醇,然后在56℃下还原30 min。

1.3.4 液相色谱-质谱联用分析

分别制备含有2%乙腈和0.1%甲酸的液相色谱流动相A溶液和含有100%乙腈和0.1%甲酸的B溶液,然后通过纳米管UHPLC系统分离溶解在流动相A溶液中的肽。将流速设置为300 NL/min,按2%～5% B,0～1 min进行;5%～27% B, 1～76 min;27%～35% B,76～82 min和35%～85% B,82～86 min。分离的肽经毛细管离子源电离,电压为1.75 kV,然后进行一次和二次(扫描范围为100～1700)串联质谱分析,动态排除时间扫描为30 s。

1.3.5 肝组织蛋白组学的生物信息学分析

(1)数据库搜索

借助Maxquant (v1.6.15.0)进行二级质谱数据检索,在Mus_musculus_10090_SP_20201214中有蛋白质序列。FASTA(17 063序列)蛋白质数据库构建理论二级光谱数据库,搜索质谱产生的二级光谱,并与理论二级光谱图进行比较,通过算法评分和过滤得到匹配的理论肽序列,完成样品蛋白质的识别,识别出的蛋白质特异性肽可以识别蛋白质信息。

(2)蛋白质的定量分析及差异表达蛋白的筛选

将肽段在不同样本中的肽信号强度值通过中心化变化后得到相应的相对定量值,进一步采用中位数归一化方法校正后用于计算蛋白的相对定量值。最后采用皮尔森相关性、主成分分析和相对标准差三种统计分析方法对蛋白质定量结果进行重复性检验,使定量结果具有统计学一致性。以重复定量值的平均值比值作为各蛋白质在AFLD组/对照组(M/C)、白藜芦醇组/AFLD组(R/M)、白藜芦醇组和对照组(R/C)3个样本比较对中的表达差异倍数,经过Log2对数转换后进行t检验分析,并计算相应的P值,以此作为显著性指标。以满足P＜0.05和差异倍数≥1.5或≤0.67两个条件进行显著上调或下调的差异表达蛋白筛选,将同时在3个样本比较组中显著差异表达的蛋白视为差异共表达蛋白。

(3)差异表达蛋白的GO、KEGG分析及蛋白质互作网络分析

对每个比较组的差异表达蛋白进行了基因本体论(GO)分类和KEGG通路分析。将3个比较组中共表达的差异蛋白进行GO功能富集及KEGG通路分析,然后将3个比较组中筛选出的差异共表达蛋白的蛋白序列与STRING(v.11.0)蛋白网络互作数据库比对,根据confidence score＞0.4提取得到差异蛋白互作关系,并对差异蛋白互作网络进行可视化展示。

1.4 统计学方法

采用SPSS 26.0软件对数据进行统计分析。组间蛋白差异倍数值比较采用Student’st检验,P＜0.05为差异具有显著性。

2 结果

2.1 白藜芦醇对AFLD小鼠肝脂肪变性的影响

经油红“O”染色后镜下观察,发现白藜芦醇干预后AFLD小鼠肝细胞脂肪变性显著减轻,具体结果可参见以往发表论文[24]。

2.2 肝组织蛋白质表达质谱鉴定、定量及差异表达蛋白质筛选结果

各实验组共鉴定出4513个蛋白质,其中定量蛋白质有3763个。M/C、R/M和R/C 3个样本比较组共筛选出1228个显著差异表达蛋白质。与对照组比较(P＜0.05),AFLD组、白藜芦醇干预组小鼠肝组织中分别有324、40个蛋白表达显著上调和分别有370、43个蛋白表达显著下调。与AFLD组比较(P＜0.05),白藜芦醇干预组小鼠肝组织分别有224、227个蛋白表达显著上调和下调(如图1)。白藜芦醇干预后能够将模型组中198个显著上调、171个显著下调表达的蛋白质分别相应地显著下调和上调。运用火山图分析3个样本比较组之间蛋白质表达水平的差异(如图2)。

图1 三个样本比较组差异表达蛋白质筛选Figure 1 Screening of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

图2 三个样本比较组差异表达蛋白质的火山图分析Figure 2 Volcanic map analysis of differentially expressed proteins in three sample comparison groups

2.3 差异表达蛋白的功能富集分析结果

1228个差异表达蛋白的GO功能富集分析显示,M/C、R/M和R/C三个比较组对分别涉及19、10、11个生物过程、19、9、8个细胞组成和14、11、13个分子功能的变化(如图3),此外,分别有13、15和17个KEGG通路显著富集(如图4)。

图3 差异表达蛋白的GO分类分析结果Figure 3 GO classification analysis results of differentially expressed proteins

图4 差异表达蛋白的KEGG富集通路分析结果Figure 4 Analysis results of KEGG enrichment pathway of differentially expressed proteins

2.4 差异共表达蛋白筛选及GO功能、KEGG通路分析

在M/C、R/C、R/M 3个比较组中筛选出11个差异共表达蛋白质,其中推测水解酶(putative hydrolase RBBP9, Rbbp9),白细胞弹性蛋白酶抑制剂A(leukocyte elastase inhibitor A, Serpinb1a),蛋氨酸-R-亚砜还原酶 B1(methionine-R-sulfoxide reductase B1, Msrb1),硫转移酶家族胞质1B(sulfotransferase family cytosolic 1B, Sult1b1)等4个蛋白在模型组中显著下调0.08～0.39倍,过氧化物酶体膜蛋白(peroxisomal membrane protein, Slc25a17),载脂蛋白A-IV(apolipoprotein A-IV, Apoa4),UDP-N-乙酰己糖胺焦磷酸化酶样蛋白1( UDP-N-acetylhexosamine pyrophosphorylase-like protein 1, Uap1l1)内质网金属肽酶1(endoplasmic reticulum metallopeptidase 1, Ermp1),甘油-3-磷酸酰基转移酶3(glycerol-3-phosphate acyltransferase 3, Gpat3),环氧化物水解酶1(epoxide hydrolase 1, Ephx1),STIP1同源性含U盒蛋白1(STIP1 homology and U box-containing protein 1, Stub1)等7个蛋白显著上调2.44～6.79倍,相应地,经白藜芦醇干预后能够分别上调1.6～6.0倍和下调0.26～0.63倍。GO功能富集分析显示,除Rbbp9、Ermp1 2个蛋白质无分子功能外,其余9个蛋白质涉及9种分子功能(如表1)。此外,KEGG通路分析显示其中Apoa4、Uap1l1、Slc25a17、Gpat3、Ephx1等5个蛋白质分别涉及脂肪消化和吸收、过氧化物、异生物质CYP450代谢和代谢等5条通路(如图5)。

图5 11个差异共表达蛋白的KEGG通路分析结果Figure 5 Analysis results of KEGG enrichment pathway of 11 differentially co-expressed proteins

表1 11个差异共表达蛋白质分子功能及差异倍数Table 1 Molecular functions and differential fold values of 11 differentially co-expressed proteins

2.5 差异共表达蛋白网络互作分析结果

11个差异共表达蛋白网络互作分析结果显示,Sult1b1、Apoa4、Agpat9(Gpat3)、Ephx1等4个蛋白具有相互作用关系,其余7个蛋白Rbbp9、Msrbl、Ermpl、Stubl、Slc25a17、Serpinbla、Uap1l1无相互作用关系(如图6)。

图6 11个差异共表达蛋白质的网络互作关系图Figure 6 Network interaction diagram of 11 differentially co-expressed proteins

3 讨论

众所周知,疾病往往伴随着多个层面的蛋白质功能障碍[26-27]。蛋白质组学技术的进步使筛选与疾病发生、防治相关的蛋白标志物成为可能[28-30]。因此,全面了解AFLD相关信号通路中涉及的蛋白质分子可能会为AFLD的发生机制理解以及开发合适的临床治疗或新药的方法提供有价值的见解。Song等[31]通过蛋白质组学方法分析了刺梨对高脂血症小鼠肝组织蛋白质表达的影响,发现了15种与脂质代谢相关的蛋白质。类似的,Dai等[32]通过定量化学蛋白质组学分析发现,从黄芩中提取的黄芩苷激活了肝肉碱棕榈基转移酶1,从而对代谢性疾病(如肝脂肪变性和肥胖)起到干预作用。Du等[33]利用蛋白质定量蛋白质组学发现,赖氨酸丙二酰化可能与2型糖尿病治疗密切相关。Liu等[34]利用蛋白质翻译后修饰技术发现泛素特异性蛋白酶14通过稳定其底物脂肪酸合酶在非酒精性脂肪肝中发挥作用。白藜芦醇作为治疗酒精性肝病研究最广泛、最有前途的膳食多酚[5-8],其具体作用分子机制仍不清楚。故本文采用更高检测深度的4D非标定量蛋白质组学分析技术,从AFLD组中获得了370个差异表达蛋白质,该结果提示慢性饮酒可导致肝组织蛋白质表达谱的显著变化,也表明这些差异蛋白可能参与了AFLD的形成。白藜芦醇干预后能分别将AFLD小鼠其中下调表达的蛋白质中的198个上调、将上调表达中的171个蛋白实现下调的结果表明,这些蛋白也可能与白藜芦醇的AFLD干预作用可能密切相关。因此,慢性酒精摄入后引起肝组织蛋白质表达谱变化的结果为后续探讨药物干预机理和完善AFLD发生机制提供了重要的研究方向。进一步的差异表达蛋白质的功能富集分析也表明这些差异表达蛋白质与多种生物学效应有关,能够通过多种途径直接或间接影响小鼠摄入酒精后的肝病理学结局。

有趣的是,运用PPI分析,我们从11个差异共表达蛋白质中发现了4个具有相互作用关系的蛋白质,即环氧化物水解酶1(Ephx1)、载脂蛋白A-IV(Apoa4)、甘油-3-磷酸酰基转移酶3(Gpat3)和硫转移酶家族胞浆1B成员(Sult1b1),然而与酒精性肝病关系尚不明确。本文检测结果显示,酒精摄入后小鼠肝组织Ephx1、Apoa4、Gpat3的表达水平均分别显著上调3.38、6.79和3.98倍,经白藜芦醇干预后均分别显著下调了0.54、0.26和0.53倍。相反地,Sult1b1在酒精摄入后显著下调0.21倍,经白藜芦醇干预后显著上调2.87倍。GO分类和KEGG通路功能富集分析显示Ephx1通过细胞色素P450代谢外源性物质途径发挥作用。Ephx1为在肝中广泛表达的解毒酶和水解酶折叠酶[35],Gautheron等[36]通过小鼠3T3-L1前脂肪细胞的Ephx1敲除实验,证明了Ephx1敲除促进细胞的氧化应激和衰老。然而也有研究证明Ephx1与细胞色素P450酶偶联[37],Davydov等[38]使用化学交联质谱法确证了Ephx1和细胞色素P450 2E1的相互作用关系。微粒体Ephx1活性的增加可能通过增加细胞色素P450活性加速酒精向其有毒代谢物乙醛的转化[39]。基于细胞色素P450 2E1与AFLD发生的密切相关性认知[40-41],这些结果表明了白藜芦醇可能通过调节Ephx1表达水平进而影响细胞色素P450活性,从而达到小鼠AFLD的保护作用。脂肪生成和分解代谢的不平衡会导致脂肪肝等代谢性疾病[42]。Apoa4是主要表达于肠上皮细胞中的交换性载脂蛋白家族成员之一,它在促进肠脂质吸收、调节脂质和葡萄糖代谢中起关键作用[43-45]。Li等[42]发现Apoa4缺乏会降低小鼠肝脂肪分解相关限速酶的表达,Apoa4会促进脂肪分解和能量代谢。此外,肝Apoa4蛋白的过度表达在肝纤维化初期和非酒精性脂肪性肝炎相关肝癌中得到证实[46-47]。Kang等[48]使用微阵列分析鉴定了参与肝脂肪代谢的人亮氨酸拉链蛋白(LZIP)诱导基因,发现LZIP和Apoa4在人类脂肪变性样品中均高度表达,并促进小鼠肝中的肝脂肪变性。近期Tryndyak等[49]利用饮食诱导的肝细胞脂肪变性体外模型,也证明了Apoa4表达的显著上调。一致地,我们的蛋白质组学数据也显示AFLD小鼠肝组织Apoa4蛋白的上调表达和白藜芦醇干预后的下调表达。提示白藜芦醇可能通过干预Apoa4的表达,调节肠道脂肪消化吸收途径参与小鼠AFLD的保护作用,不过需要进一步的验证。Gpat3是甘油-3-磷酸酰基转移酶的一种亚型酶,在脂肪组织中高度表达,有研究证明Gpat3的敲低不仅减少甘油三酯的合成,还会损害脂肪的生成[50]。Gao等[51]通过Seipin/Gpat3敲除小鼠体内实验,也发现Gpat3的缺乏能够缓解严重先天性全身性脂肪营养不良小鼠模型中的胰岛素抵抗和肝脂肪变性。Pagac等[52]在运用3T3-L1前脂肪细胞,发现敲低Gpat3显著增强了脂肪细胞分化,而Sim等[53]通过Gpat3过表达3T3-L1细胞实验发现增强的Gpat3活性将积极调节脂肪细胞分化。Khatun等[54]发现Gpat3敲除小鼠表现出减弱的血浆甘油三酯偏移和肠细胞中积聚的脂质等结果证明了Gpat3是参与肠脂代谢的新型酶,肠道Gpat3是脂质吸收的次要途径。因此,研究这个蛋白是否通过脂肪细胞分化、肠道脂质吸收失衡来参与酒精诱导的脂肪肝及作为药物干预作用靶点将会是非常有意义的。综合我们的蛋白质组学定量数据和功能富集分析结果,提示,通过调节Gpat3对肝脂质稳态代谢通路的影响也可能是白藜芦醇发挥抗AFLD的重要途径。作为SULT家族成员之一的Sult1b1是小肠中表达并参与人体异源解毒的主要酶,与SULT1A3/4一起主要构成组织中硫转移酶蛋白质[55-56]。Lian等[57]近期通过生物信息学分析和qRT-PCR鉴定、验证了Sult1b1在结直肠癌细胞中表达水平的显著降低,确定了是结直肠癌转移的新型生物标志物。然而Sult1b1虽然在药物、环境毒素和内源性类固醇的代谢中起重要作用已经被证实[58],但是很少有研究显示Sult1b1表达或活性在酒精摄入后肝病理条件下的变化。我们研究结果表明了AFLD小鼠肝组织中Sult1b1的显著表达下调和白藜芦醇干预后的显著上调。GO功能富集分析结果显示该蛋白涉及催化活性和转移酶活性两种分子功能,提示通过上调Sult1b1表达增强其发挥清除外源性物质、加强酒精代谢可能参与白藜芦醇的小鼠的AFLD保护作用,有必要深入了解具体的分子作用机理。

综上所述,我们研究了AFLD小鼠肝组织中蛋白质表达谱的变化及其与白藜芦醇干预作用的可能相关性。白藜芦醇至少通过正向或负向调节Sult1b1、Apoa4、Gpat3、Ephx1等4个蛋白质的表达,发挥调节肠道脂肪消化、细胞色素P450代谢外源性物质途径和代谢途径来减轻小鼠肝的酒精性脂肪变性,有望成为新的治疗AFLD的靶点,值得进一步探讨。