细叶十大功劳叶中总生物碱大孔树脂纯化及抗氧化研究

贾 凯， 刘 俊， 耿晓桐， 张耀洲， 肖 颖

( 信阳农林学院 制药工程学院， 河南 信阳464000 )

细叶十大功劳(Mahoniafortunei)系小檗科(Berberidaceae)十大功劳属(MahoniaNutt.)常绿灌木，是一种常见的药用植物，具有清热解毒、滋阴强壮之功效(中国科学院《中国植物志》编委会，2001)，用于治疗痢疾、腹泻、咽炎、牙痛等。现代药理表明，该属植物具有抗菌(蒲忠慧等，2016)、抗炎(Hu et al.，2016)及抗肿瘤(Wong et al.，2009)等生物活性，临床上主要用于湿疹(Donsky & Clarke，2007)和牛皮癣(Janeczek et al.，2018)的治疗。《中国药典》(2020年版)收载的细叶十大功劳药用部分为其干燥茎，有效成分主要为小檗碱、药根碱、巴马汀等生物碱(国家药典委员会，2020)。研究表明该植物的叶同样也含有此类成分(樊丽博等，2011；张耀洲等，2017)。目前，对于十大功劳总生物碱的化学研究多集中在含量测定(张耀洲等，2017；钟南海，2019)、提取工艺(周先强等，2015；严志伟等，2015)方面，纯化工艺研究多见于用一些色谱方法进行单体的分离(崔泽旭等，2018)，而对于总生物碱有效部位的纯化研究尚未见报道。据统计，我国2009—2018年获得生产批准的5 类中药新药共18项(张广斌等，2021)，可见对中药有效部位的开发已成为中药创新药物研发的重要方向。然而，为达到5 类中药新药有效部位含量必须高于50%的要求，建立适用于工业化生产的纯化工艺就成为新药研发成功与否的关键问题。在获批生产的5 类中药新药中，应用大孔树脂纯化工艺的占50%(张广斌等，2021)，可见大孔树脂纯化技术已成为中药有效部位纯化的常用且有效手段。

另外，Hu等(2011)报道同属植物阔叶十大功劳叶的水提物表现出良好的抗氧化活性，但未对抗氧化活性物质基础做进一步研究，而功劳木生物碱类成分具有一定的抗氧化能力，且总生物碱抗氧化能力强于单体成分(朱姮等，2016)。为给工业生产上简便、高效地获得高纯度、高活性的细叶十大功劳总生物碱提供参考，促进细叶十大功劳叶部资源的开发利用，本研究以其叶中总生物碱有效部位为研究对象，采用大孔树脂纯化技术和DPPH抗氧化性能评价方法，通过比较6种不同极性大孔树脂对总生物碱的吸附和解吸特性以及总生物碱纯化前后的抗氧化活性变化，拟探讨以下问题：(1)细叶十大功劳叶总生物碱有效部位大孔树脂纯化工艺参数的优化；(2)细叶十大功劳叶总生物碱的体外抗氧化活性的初步评价。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

仪器：TU-1810型紫外-可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司)；AB135-S型电子天平[梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司]；DKZ-1型恒温振荡水槽(上海一恒科学仪器有限公司)；RE-52A型旋转蒸发器(上海亚荣生化仪器厂)。

试剂：D101、AB-8、ADS-3、DA201、NKA-9、LD605大孔树脂(天津浩聚树脂科技有限公司)；盐酸小檗碱对照品(批号为HB03313，纯度≥98%，供含量测定用，陕西华昱生物科技有限公司)；1,1-二苯基-2-苦基肼(DPPH，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司)；Vc(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)；乙醇(分析纯，天津市大茂化学试剂厂)；水为纯化水。

鲜细叶十大功劳叶12月下旬采自信阳农林学院校园内，经信阳农林学院中药资源与开发教研室梁利香副教授鉴定为小檗科十大功劳属植物细叶十大功劳(Mahoniafortunei)。样品处理：洗净，阴干，除去叶柄，粉碎，过40目筛备用。

1.2 方法

1.2.1细叶十大功劳叶中总生物碱的含量测定 按照文献方法测定(张耀洲等，2017)。以盐酸小檗碱为对照品，测定波长为345 nm，采用紫外分光光度法测定总生物碱质量浓度，盐酸小檗碱线性回归方程A=0.063 73C- 0.006 81(R2=0.999 9)。

1.2.2 上样溶液及总生物碱粗品的制备 取细叶十大功劳叶粉末约100 g(过40目筛)，精密称定，加8倍生药体积的75%乙醇加热回流提取3次，每次2 h。冷至40 ℃，滤过，滤液合并，减压浓缩至无醇味，静置过夜。过滤除去析出的黑色胶状物质，滤液加水定容至相当于原生药25倍体积(相当于含生药量40 mg·mL-1)，即得上样溶液。依法可制得其他浓度的上样溶液。按相同的提取方法，滤液经浓缩、真空干燥至恒重，即得总生物碱粗品(纯度13.33%)，置于干燥器中备用。

1.2.3 大孔吸附树脂型号的选择

1.2.3.1树脂的预处理 分别取一定量的不同型号树脂(D101、AB-8、ADS-3、DA201、NKA-9、LD605)置于95%乙醇中浸泡12 h，充分溶胀后，湿法装柱，95%乙醇洗至流出液加适量水无白色浑浊出现，再用纯化水洗至无乙醇味为止，备用。

1.2.3.2 不同树脂的静态吸附实验和解吸实验考察 精密称取上述已处理好的树脂各1.0 g，分别置于100 mL锥形瓶中，加入上样溶液20 mL(生药浓度为40 mg·mL-1)，置恒温振荡水槽中振荡吸附2 h(30 ℃，120 r·min-1)，然后静置24 h。滤过，滤液经适当稀释后测定吸光度计算出总生物碱质量浓度，计算饱和吸附量和静态吸附率。将抽滤后的树脂吸干表面水分后分别转移至100 mL锥形瓶中，加入95%乙醇30 mL，置恒温振荡水槽中振荡解吸2 h(30 ℃，120 r·min-1)，然后静置24 h。滤过，滤液经适当稀释后测定吸光度计算出总生物碱质量浓度，计算吸附率与解吸率。

1.2.3.3 不同树脂的动态吸附、洗脱实验考察 分别将预处理过的D101、AB-8、LD605树脂湿法装柱(1.0 cm × 20 cm，装柱量10 mL)。缓慢加入上样溶液100 mL(生药浓度为40 mg·mL-1)，控制流速为2 BV·h-1，收集流出液。将吸附后的各树脂柱先后用纯化水50 mL、80%乙醇100 mL洗脱，控制流速为2 BV·h-1，收集流出液。各流出液经适当稀释后测定吸光度，计算出总生物碱质量浓度、动态吸附率、动态解吸率。

1.2.4 AB-8大孔吸附树脂纯化总生物碱的工艺研究

1.2.4.1 上样溶液浓度的确定 取预处理过的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱(1.0 cm × 20 cm，装柱量10 mL)。将不同生药浓度的十大功劳上样液以2 BV·h-1的流速上样，每2 BV为1个流分，经适当稀释后测定各流分中的总生物碱质量浓度，进行不同上样浓度对树脂饱和吸附量的实验。

1.2.4.2 上样流速和上样量的确定 取相同质量预处理过的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱(1.0 cm × 20 cm，装柱量10 mL)。将上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)以不同流速上样，进行不同上样流速对树脂饱和吸附量的实验。

1.2.4.3 洗脱杂质用水量的确定 取预处理过的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱(1.0 cm × 20 cm，装柱量10 mL)。将260 mL上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上样，吸附完全后，用水洗脱，每1 BV为1个流分，测定总生物碱质量浓度，同时将每一流分浓缩干燥，称其固形物质量，以总生物碱在固形物中的含量高低确定洗脱杂质用水量。

1.2.4.4 乙醇洗脱剂浓度及用量的确定 取4等份预处理过的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱(1.0 cm × 20 cm，装柱量10 mL)。将260 mL上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上样，吸附完全后，用水洗脱3 BV后，分别用30%、40%、50%、60%乙醇洗脱，收集洗脱液，每1 BV为1个流分，绘制洗脱曲线。

1.2.4.5 验证性实验 取预处理过的AB-8大孔吸附树脂，湿法装柱(2.6 cm×30 cm，装柱量100 mL)。将2.6 L上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)以2 BV·h-1流速上样，吸附完全后，用水洗脱3 BV后，再用50%乙醇洗脱4 BV，收集乙醇洗脱液，浓缩、干燥，测定总生物碱质量浓度。重复3次验证实验。

1.2.5 总生物碱抗氧化活性测定 采用常用的DPPH自由基清除法来评价总生物碱的抗氧化活性。参照文献(李侠等，2018)方法并略作修改。精密称取DPPH 10 mg，置250 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1×10-4mol·L-1(40 μg·mL-1)的DPPH工作液。精密称取“1.2.2”项中总生物碱粗品(黑绿色固体)、“1.2.4.5”项中总生物碱纯化品(黄绿色固体)和阳性对照品VC各10 mg，置于100 mL容量瓶中，用95%乙醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得质量浓度为100 μg·mL-1的各待测溶液。各待测溶液对半稀释成5个浓度。实验组精密量取上述不同浓度的待测溶液2 mL与DPPH工作液2 mL置于10 mL具塞试管中，摇匀，室温下暗处放置30 min。依相同的方法，以不同浓度的待测溶液与95%乙醇混合作为对照组，以95%乙醇与DPPH工作液混合作为空白组。以95%乙醇调零，测定各组在517 nm处的吸光度。每个浓度平行测定3次。依如下公式计算DPPH自由基清除率。

式中：A0为空白组的吸光度值；A1为实验组的吸光度值；A2为对照组的吸光度值。

2 结果与分析

2.1 总生物碱的含量测定结果

细叶十大功劳叶中总生物碱含量以盐酸小檗碱计为4.16%。按标准曲线法求出上样溶液中总生物碱质量浓度为1.43 mg·mL-1(生药浓度为40 mg·mL-1)、1.76 mg·mL-1(生药浓度为50 mg·mL-1)。

2.2 大孔吸附树脂型号筛选结果

2.2.1 不同树脂的静态吸附实验和解吸实验结果 根据十大功劳中生物碱的性质及各种树脂的性能，选取6种树脂进行考察，结果见表1。

从表1可以看出，D101、AB-8、LD605树脂的吸附性能和解吸附性能都优于ADS-3、DA201及NKA-9，因此需对这3种树脂做进一步考察，优选出最佳型号的树脂。

表 1 不同型号大孔树脂对细叶十大功劳总生物碱的静态吸附率和解吸率Table 1 Static adsorption and desorption rates of total alkaloids in Mahonia fortunei by different macroporous resins

2.2.2 不同树脂的动态吸附、洗脱实验结果 对D101、AB-8、LD605这3种树脂做动态吸附、洗脱实验考察，结果见表2。从表2可以看出，3种树脂洗脱能力差别不大，经水、乙醇洗脱后，95%左右的总生物碱都能被洗脱下来。但AB-8树脂动态吸附能力要较LD605、D-101好，综合考虑3种树脂的动态吸附和洗脱能力，优选AB-8大孔树脂进行细叶十大功劳提取液的纯化工艺实验。

表 2 不同大孔型号树脂对细叶十大功劳总生物碱的动态吸附率和解吸率Table 2 Dynamic adsorption and desorption rates of total alkaloids in Mahonia fortunei by different macroporous resins

2.3 AB-8大孔吸附树脂纯化总生物碱的工艺研究结果

2.3.1 上样溶液浓度的确定 按“1.2.4.1”项的方法收集流分，并测定每流分中总生物碱质量浓度，以其与上样溶液总生物碱质量浓度比值为纵坐标，流出液体积为横坐标绘制不同上样溶液浓度下的穿透曲线，并计算各浓度下的饱和吸附量，结果见图1和图2。从图1和图2可以看出，在一定浓度范围内，随着上样液浓度增大，穿透时间提前，树脂对总生物碱的饱和吸附量增大。当上样液浓度超过50 mg·mL-1生药浓度后，树脂吸附量略有所下降，可能由于高浓度上样液中杂质与总生物碱竞争吸附导致。另外，高浓度上样液在静置后易出现沉淀浑浊现象。综合以上因素考虑，上样溶液浓度确定为50 mg·mL-1生药浓度。

图 1 不同上样液浓度下的穿透曲线Fig. 1 Breakthrough curves at different concentrations of sample solution

图 2 不同上样溶液浓度下的饱和吸附量Fig. 2 Saturated adsorption capacity at different concentrations of sample solution

2.3.2 上样流速和上样量的确定 上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)以不同流速上样，AB-8树脂饱和吸附量分别为44.82 mg·mL-1(1 BV·h-1)、43.05 mg·mL-1(2 BV·h-1)、40.83 mg·mL-1(3 BV·h-1)、38.58 mg·mL-1(4 BV·h-1)。可以看出，流速越小，树脂的饱和吸附量越大，越有利于生物碱的吸附。但流速过小，上样时间长，吸附效率低。考虑到不同流速下树脂的饱和吸附量相差不大，为提高过柱效率，选择流速为2 BV·h-1。经计算，当流速为2 BV·h-1，上样量为26 BV时，上样液浓度下降接近50%，树脂吸附量为饱和吸附量的86.69%。因此，选择上样量为26 BV药液。

2.3.3 洗脱杂质用水量的确定 上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)，上样量26 BV，流速2 BV·h-1条件下，水洗结果见表3。从表3可以看出，当洗脱用水量为3 BV时，固形物中总生物碱含量达到24.12%，总生物碱损失较大。考虑到除杂目的及减少总生物碱损失，确定杂质洗脱用水量为3 BV。

2.3.4 乙醇洗脱剂浓度及用量的确定 上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)，上样量26 BV，流速2 BV·h-1条件下，水洗3 BV后，醇洗结果见图3。从图3可以看出，随着乙醇洗脱剂浓度的增大，洗脱能力增强，生物碱集中出现在50%及60%乙醇洗脱液中，但60%乙醇洗脱较50%乙醇洗脱增加不明显。50%乙醇在4 BV内可将总生物碱的90%以上洗脱下来，故选择50%乙醇作为洗脱剂，用量为4 BV。

表 3 不同体积水洗脱结果Table 3 Eluting results with different volumes of water

图 3 不同浓度洗脱溶液下的洗脱曲线Fig. 3 Eluting curves at different elution solution concentrations

2.3.5 验证性实验结果 上样溶液(生药浓度为50 mg·mL-1)，上样量26 BV，流速2 BV·h-1条件下，水洗3 BV后，50%乙醇洗4 BV，验证结果见表4。

表 4 验证性实验结果Table 4 Confirmatory test result

2.3.6 总生物碱抗氧化活性 总生物碱抗氧化活性结果如图4所示。从图4可以看出，在测试浓度6.25～100 μg·mL-1范围内， 十大功劳总生物碱粗品、纯化品及对照品Vc对DPPH自由基的清除率随着浓度的增加而增加，其对DPPH自由基半抑制浓度IC50分别为55.28、39.08、10.39 μg·mL-1。说明不同纯度的十大功劳总生物碱对DPPH自由基都具有一定的清除作用，且经大孔树脂纯化后抗氧化能力有了较大提升，但在相同质量浓度时都比对照品Vc低。

图 4 DPPH自由基清除能力比较Fig. 4 Comparison of DPPH free radical scavenging ability

3 讨论与结论

制备上样溶液时，提取液浓缩后需静置一段时间，待黑色胶状物质析出完全去除后再稀释，否则上样溶液在放置过程中会有黑色胶状物质析出，影响吸附效果。另外，上样溶液浓度不宜过高，否则上样溶液在静置过程中会出现浑浊现象，可能为细叶十大功劳总生物碱在水中溶解度较小所致。

不同类型的大孔树脂对化合物的吸附及解吸能力不同，因此选择适当的树脂非常重要。实验选取6种不同极性的大孔树脂，对比其对总生物碱的静态吸附和动态洗脱能力，结果显示弱极性(如AB-8、LD605)及非极性(如D101)树脂对细叶十大功劳总生物碱有较大的吸附量。结合洗脱能力的比较，最终选取AB-8大孔树脂用于细叶十大功劳总生物碱的纯化实验。这与文献(刘丽梅等，2010；林叶新等，2013)报道的同样含有盐酸小檗碱的黄柏、黄连药材总生物碱纯化选取的大孔树脂型号一致。AB-8大孔树脂纯化工艺为：上样浓度为50 mg·mL-1生药浓度，上样量为26 BV，上样流速为2 BV·h-1，3 BV水洗后经4 BV 50%乙醇洗脱，收集乙醇洗脱液，浓缩即得总生物碱。经AB-8大孔树脂纯化后的总生物碱含量符合5 类中药新药有效部位含量应高于50%的要求。

同细叶十大功劳药用部位茎相似，生物碱也是叶中主要的有效成分。此类生物碱多为季铵型生物碱，如主要成分小檗碱、药根碱等，具有广泛的药理活性。小檗碱既能抑制活性氧(reactive oxygen species，ROS)生成，又可诱导抗氧化防御能力，又能使病变细胞发生氧化应激，具备理想抗氧化剂的潜质(赵雪莉等，2019)。基于抗氧化剂在神经退行性疾病的预防和治疗方面的药理作用，刘久石(2019)研究发现，含有大量小檗碱及其衍生物的功劳木药材作为潜在治疗神经退行性疾病药物具有重大潜力。本研究抗氧化活性表明，不同纯度的十大功劳总生物碱均具有一定的抗氧化能力，且纯化后的总生物碱抗氧化能力也有一定的提高。因此，在细叶十大功劳药材的利用过程中，也应注重对非药用部位叶的开发和利用。

从细叶十大功劳叶中提取分离总生物碱，为充分利用该药材非药用部位资源提供可行性探索。AB-8大孔树脂纯化十大功劳总生物碱工艺条件简单可行，纯化效果好，工艺稳定，可为细叶十大功劳总生物碱开发、制备及工业化生产提供参考。