黔产大青化学成分及其抗菌活性研究

霍晓敏， 李丽君， 冉坚强， 薛 站， 刘丽娜， 谭承建*

( 1. 贵州民族大学 民族医药学院， 贵阳 550025； 2. 贵州民族大学 化学工程学院， 贵阳 550025； 3. 贵州医科大学 生物与工程学院， 贵阳 550025 )

奶牛乳房炎是我国奶牛养殖业的常见疾病，主要是由金黄色葡萄球菌、链球菌、无乳链球菌等引起的炎症(王丽芳等，2020)。目前，奶牛乳房炎的防治主要依靠抗生素，但抗生素的长期滥用会引起耐药菌的产生，威胁公共卫生安全(徐鸿润等，2021)。临床上，中草药被广泛用于细菌感染、炎症消除等疾病的防治，因其毒副作用较小，且不易产生耐药性(张晓东等，2021)，为抗奶牛乳房炎药物的研究提供了新思路。研究表明，中草药的天然有效成分可以直接抑制致病菌的生长繁殖，减弱其致病性，雪白睡莲花、蒲公英、连翘、金银花等提取物均对奶牛乳房炎的致病菌如金黄色葡萄球菌、大肠杆菌有明显的抑制作用(钟华晨等，2020；刘丹丹等，2021)；中草药中皂苷类、黄酮类等天然活性成分可以通过影响炎症因子的分泌，增强免疫能力，抵御致病菌的入侵进而降低奶牛乳房炎的发病率(候昆等，2019)。

大青(Clerodendrumcyrtophyllum)又称路边青、山大青，为马鞭草科大青属植物，主要分布于我国华东、中南、西南(四川除外)各省区(裴鉴和陈守良，1982)。《本草纲目》中记载大青味苦性寒，有清热解毒的功效。在贵州省黔东南苗族地区，大青是一味常用的民族药物，苗医用大青的水煎液内服来治疗小儿感冒发烧，疱疹病毒感染如口疮、带状疱疹等疾病(陆科闵和王福荣，2006)。大青提取物具有一定的抗菌活性(白云霄等，2013)，但其中的活性成分未被阐明。因此，为深入探究大青中抗菌活性成分，拟为大青抗奶牛乳房炎药物的研发提供基础研究数据。本研究以黔产大青为研究对象，依托民族医药研究平台，采用现代色谱分离手段、现代波谱学技术和现代药理学方法，拟探讨以下问题：(1)黔产大青乙醇提取物的化学成分；(2)分离得到的部分化合物的抗菌活性。

1 材料与方法

1.1 材料、仪器和试剂

1.1.1 材料 大青药材采自于贵州省贵定县云雾镇，经贵阳中医学院孙庆文教授鉴定为马鞭草科大青属植物大青(Clerodendrumcyrtophyllum)。凭证标本(GZQSY2015D45)存放于贵州民族大学天然药物化学实验室。乳房链球菌(Streptococcusuberis)、无乳链球菌(S.agalactiae)由广东省农业科学院提供。

1.1.2 仪器和试剂 Avance NEO400型核磁共振波谱仪(德国 BruKer 公司)；Xevo G2-S QTof型质谱仪(美国 Waters 公司)；UltiMate 3000型高效液相色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)；XBridge BEH C18半制备型色谱柱(10 mm×250 mm，5 μm，美国 Waters 公司)；Rotavapor R-3型数显旋转蒸发仪(瑞士步琦有限公司)；LiChroperp RP-18(40～63 μm，德国 Merck 公司)；Sephedex LH-20(瑞典 Pharmacia 公司)；柱色谱硅胶(青岛海洋化工厂公司产品)；ZF-6型三用紫外分析仪(上海嘉鹏科技有限公司)；HZT-A1000型电子天平(福州闽衡电子仪器有限公司)；DB-1型电热板(常州国华电器有限公司)；全波长酶标仪(芬兰 Thermo 公司)；全自动酶标仪(美国 BioTek 公司)；MTT噻唑蓝(北京 Solarbio 生物科技有限公司)；PBS磷酸缓冲液(北京 Solarbio 生物科技有限公司)；SDS十二烷基硫酸钠(分析纯，美国 Sigma 公司)；甲醇、二氯甲烷、石油醚、乙酸乙酯、正丁醇等分析纯试剂(成都科隆化学品有限公司)；甲醇、乙腈等色谱纯试剂(上海星可高纯溶剂有限公司)；显色剂为5%硫酸乙醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 提取与分离 将25 kg干燥的大青(地上部分)粉碎，用95%乙醇热回流提取3次，每次2 h，提取液合并，经减压浓缩后得到粗浸膏1 136 g。粗浸膏用水混悬，得到悬浮液，然后依次用等体积的石油醚、二氯甲烷、正丁醇进行萃取，之后分别对其进行减压浓缩得到石油醚部位172 g，二氯甲烷部位41 g，正丁醇部位429 g，水部位373 g。

取石油醚部位103 g，经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=200∶1、100∶1、50∶1、20∶1、5∶1、1∶1)梯度洗脱，得到13个不同流分，石油醚∶乙酸乙酯=200∶1洗脱得到流分Fr.a，石油醚∶乙酸乙酯=100∶1洗脱得到流分Fr.b1-2，石油醚∶乙酸乙酯=50∶1洗脱得到流分Fr.c1-2，石油醚∶乙酸乙酯=20∶1洗脱得到流分Fr.d1-3，石油醚∶乙酸乙酯=5∶1洗脱得到流分Fr.e1-3，石油醚∶乙酸乙酯=1∶1洗脱得到流分Fr.f1-2。Fr.b1经反复重结晶得到化合物1(589.5 mg)；Fr.b2经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=50∶1)、Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脱得到化合物2(8.4 mg)、3(10.2 mg)。Fr.d1经反复重结晶得到化合物4(114.2 mg)；Fr.d2经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=30∶1)、Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脱得到化合物5(7.2 mg)；Fr.d3经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=20∶1)洗脱得到化合物6(9.1 mg)。Fr.e2经硅胶柱(石油醚∶乙酸乙酯=10∶1)洗脱得到化合物7(9.8 mg)。Fr.f1经硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇=30∶1)、2次Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)洗脱得到化合物8(18.3 mg)；Fr.f2经硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇=30∶1)洗脱得到化合物9(52.1 mg)。

取正丁醇部位397 g，经大孔树脂D101柱以乙醇(30%、50%、70%、90%、100%)梯度洗脱，得到11个不同流分，30%乙醇洗脱流分Fr.A；50%乙醇洗脱流分Fr.B1-3；70%乙醇洗脱流分Fr.C1-4；90%乙醇洗脱流分Fr.D1-2；100%乙醇洗脱流分Fr.E。Fr.B2经反相RP-18柱分离，甲醇-水(35%～100%)梯度洗脱，得到Fr.B2-1～Fr.B2-4。取Fr.B2-3经2次Sephadex LH-20 柱(甲醇)洗脱，得到化合物11(11.7 mg)；经半制备高效液相色谱(C18柱，水∶乙腈=78∶22)分离，得到化合物10(19.2 mg)。取Fr.B3经反相RP-18柱分离和甲醇-水(35%～100%)梯度洗脱，得到Fr.B3-1～Fr.B3-3，取Fr.B3-2经Sephadex LH-20 柱(甲醇)分离和硅胶(二氯甲烷∶甲醇=30∶1～1∶1)梯度洗脱，得到化合物12(27.4 mg)。Fr.C1经反相RP-18柱分离和甲醇-水(30%～100%)梯度洗脱，得到Fr.C1-1～Fr.C1-5。取Fr.C1-2经Sephadex LH-20 柱(甲醇)分离和半制备高效液相色谱(乙腈∶0.1%磷酸水溶液=18∶82)纯化后得到化合物13(21.1 mg)、14(15.3 mg)。Fr.C2经反相RP-18柱分离和甲醇-水(30%～100%)洗脱后，得到Fr.C2-1～Fr.C2-4。取Fr.C2-1经2次Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)、硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇=20∶1)洗脱得到化合物15(37.4 mg)；取Fr.C2-2经Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)、硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇=12∶1)洗脱，反复重结晶得到化合物16(29.5 mg)；取Fr.C2-3经两次Sephadex LH-20 柱(二氯甲烷∶甲醇=1∶1)、半制备高效液相色谱(水∶甲醇=56∶44)洗脱，得到化合物17(7.7 mg)。Fr.C3经反相RP-18柱分离和甲醇-水(35%～100%)洗脱后，得到Fr.C3-1～Fr.C3-4。取Fr.C3-3经Sephadex LH-20 柱(甲醇)、硅胶柱(二氯甲烷∶甲醇=20∶1)洗脱，得到化合物18(53.2 mg)。

1.2.2 抗菌活性实验 抗菌活性测定参考课题组前期建立的一种定量检测细菌活菌数的MTT方法(马林玉等，2021)，取适量乳房链球菌、无乳链球菌分别接种于肉汤培养基，于37 ℃培养12 h，分别将菌液稀释至106CFU·mL-1，备用。取96孔培养板，每孔加入菌液90 μL，将96孔板划分DMSO阴性对照组、氨苄青霉素阳性对照组和8个浓度的给药组，每组设置3个复孔，取10 μL样品溶液加入给药组各孔。于37 ℃暗培养24 h(无乳链球菌无氧环境)。每孔加入45 μL 0.5 mg·mL-1MTT溶液。空白凋零组加入与MTT等量的PBS，继续避光培养4 h。显色的菌液离心(12 000 r·min-1、4 ℃、10 min)，弃上清液，加入125 μL DMSO。向已完全溶解的产物中加入150 μL的SDS，取200 μL混合溶液转移至96孔板中，用全自动酶标仪测定OD570。

2 结果与分析

2.1 结构鉴定

化合物1无色针状结晶，C30H50O，ESI-MSm/z：449.4 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：1.18(3H，s，H-28)，1.05(3H，s，H-27)，1.01(3H，s，H-30)，1.00(3H，s，H-26)，0.95(3H，s，H-29)，0.88(3H，d，J= 6.5 Hz，H-23)，0.87(3H，s，H-25)，0.72(3H，s，H-24)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：22.41(C-1)，41.65(C-2)，213.36(C-3)，58.34(C-4)，42.27(C-5)，41.41(C-6)，18.37(C-7)，53.22(C-8)，37.57(C-9)，59.60(C-10)，35.47(C-11)，30.12(C-12)，39.38(C-13)，38.42(C-14)，32.55(C-15)，36.14(C-16)，30.63(C-17)，42.91(C-18)，35.75(C-19)，28.30(C-20)，32.90(C-21)，39.82(C-22)，6.96(C-23)，14.79(C-24)，18.08(C-25)，18.80(C-26)，20.39(C-27)，32.22(C-28)，35.16(C-29)，31.92(C-30)。以上数据与文献(Toshihiro et al.，1992)一致，故鉴定化合物1为木栓酮。

化合物2白色油状物，C46H80O2，ESI-MSm/z：687.4 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.12(1H，t，J= 3.6 Hz，H-12)，4.51(1H，m，H-3)，2.29(1H，m，H-2′)，1.07(3H，s，H-27)，1.01(3H，s，H-25)，0.98(3H，s，H-26)，0.92(3H，d，J= 7.2 Hz，H-30)，0.91(3H，s，H-23)，0.89(3H，s，H-24)，0.89(3H，d，J= 6.7 Hz，H-29)，0.80(3H，s，H-28)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：38.59(C-1)，23.79(C-2)，80.75(C-3)，37.90(C-4)，55.41(C-5)，18.40(C-6)，33.02(C-7)，40.18(C-8)，47.78(C-9)，36.95(C-10)，23.52(C-11)，124.48(C-12)，139.78(C-13)，42.22(C-14)，28.81(C-15)，26.76(C-16)，33.90(C-17)，59.21(C-18)，39.76(C-19)，39.80(C-20)，31.40(C-21)，41.69(C-22)，28.24(C-23)，17.01(C-24)，15.88(C-25)，16.97(C-26)，23.39(C-27)，28.24(C-28)，17.66(C-29)，21.55(C-30)；173.88(C-1′)，35.02(C-2′)，34.58-22.85(C-3′-15′)，14.28(C-16′)。以上数据与文献(Fatma et al.，2016)一致，故鉴定化合物2为α-amyrin palmitate。

化合物3无定形白色粉末，C46H80O2，ESI-MSm/z：687.6 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.69(1H，s，H-29)，4.57(1H，s，H-29)，4.47(1H，dd，J= 10.6，5.7 Hz，H-3)，2.30(2H，t，J= 7.5 Hz，H-2′)，1.68(3H，s，H-30)，1.03(3H，s，H-27)，0.94(3H，s，H-24)，0.86(3H，s，H-23)，0.79(3H，s，H-16′)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.98(C-1)，23.89(C-2)，80.78(C-3)，38.51(C-4)，55.52(C-5)，18.14(C-6)，34.35(C-7)，40.99(C-8)，50.48(C-9)，38.19(C-10)，21.09(C-11)，25.32(C-12)，37.23(C-13)，42.97(C-14)，27.58(C-15)，35.71(C-16)，43.14(C-17)，48.43(C-18)，48.15(C-19)，151.10(C-20)，29.85(C-21)，40.14(C-22)，28.11(C-23)，16.12(C-24)，16.72(C-25)，16.31(C-26)，14.66(C-27)，18.35(C-28)，109.50(C-29)，19.43(C-30)；173.89(C-1′)，35.01(C-2′)，25.24(C-3′)，29.32-29.97(C-4′-13′)，32.08(C-14′)，22.84(C-15′)，14.27(C-16′)。以上数据与文献(Lin & Tome，1988)一致，故鉴定化合物3为sambuculin A。

化合物4无色针状结晶，C29H46O，ESI-MSm/z：433.3 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，d，J= 3.5 Hz，H-6)，5.24(1H，dd，J= 15.3，7.9 Hz，H-22)，5.21(1H，dd，J= 12.7，7.5 Hz，H-23)，4.69(2H，m，H-27)，3.93(1H，m，H-3)，1.25(3H，s，H-19)，1.65(3H，s，H-26)，1.02(3H，d，J= 4.7 Hz，H-21)，0.83(3H，t，J= 7.6 Hz，H-29)，0.69(3H，s，H-18)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.33(C-1)，31.72(C-2)，71.92(C-3)，42.34(C-4)，140.82(C-5)，121.80(C-6)，31.98(C-7)，32.02(C-8)，50.23(C-9)，36.60(C-10)，21.15(C-11)，39.76(C-12)，42.35(C-13)，56.93(C-14)，24.40(C-15)，29.79(C-16)，55.96(C-17)，12.14(C-18)，19.48(C-19)，40.28(C-20)，20.88(C-21)，137.29(C-22)，130.12(C-23)，52.08(C-24)，148.71(C-25)，20.31(C-26)，109.60(C-27)，25.79(C-28)，12.23(C-29)。以上数据与文献(Kitajima & Tanaka，1993)一致，故鉴定化合物4为22-dehydroclerosterol。

化合物5无色油状物，C20H28O3，ESI-MSm/z：339.2 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.12(1H，m，H-3′)，5.76(1H，s，H-9)，2.38-2.44(2H，m，H-2)，2.07(3H，s，H-13)，1.98(3H，d，J= 1.5 Hz，H-5′)，1.89(3H，s，H-4′)，1.87(3H，s，H-12)，1.04(3H，s，H-14)，1.02(3H，d，J= 6.8 Hz，H-15)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：31.46(C-1)，29.70(C-2)，73.27(C-3)，46.28(C-4)，42.23(C-5)，40.77(C-6)，127.79(C-7)，192.36(C-8)，125.67(C-9)，167.43(C-10)，144.29(C-11)，20.96 (C-12)，21.46(C-13)，16.16(C-14)，9.80(C-15)；167.58(C-1′)，126.93(C-2′)，137.56(C-3′)，14.57(C-4′)，19.36(C-5′)。以上数据与文献(Wang et al.，2014)一致，故鉴定化合物5为isopetasin。

化合物6无色针状结晶，C46H80O2，ESI-MSm/z：703.6 [M+K]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：4.64(2H，d，J= 7.1 Hz，H-30)，4.48(1H，dd，J= 10.7，5.6 Hz，H-3)，1.04(3H，s，H-27)，1.03(3H，s，H-26)，1.00(3H，s，H-25)，0.99(3H，s，H-28)，0.90(3H，s，H-23)，0.88(3H，s，H-24)，0.87(3H，d，J= 6.0 Hz，H-29)，0.84(3H，s，H-16′)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：38.44(C-1)，23.71(C-2)，80.55(C-3)，37.85(C-4)，55.47(C-5)，18.17(C-6)，33.98(C-7)，40.95(C-8)，49.94(C-9)，37.02(C-10)，21.40(C-11)，25.18(C-12)，38.75(C-13)，42.33(C-14)，25.87(C-15)，40.01(C-16)，35.28(C-17)，47.65(C-18)，38.54(C-19)，153.66(C-20)，25.04(C-21)，39.02(C-22)，27.97(C-23)，16.57(C-24)，15.89(C-25)，16.36(C-26)，14.14(C-27)，26.30(C-28)，19.25(C-29)，107.40(C-30)；173.75(C-1′)，34.05(C-2′)，25.18(C-3′)，29.69(C-4′-C-13′)，31.94(C-14′)，22.71(C-15′)，18.10(C-16′)。以上数据与文献(Patra et al.，1981)一致，故鉴定化合物6为taraxasteryl palmitate。

化合物7白色针状结晶，C29H48O，ESI-MSm/z：451.4 [M+K]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，d，J= 5.1 Hz，H-6)，5.15(1H，dd，J= 15.2，8.6 Hz，H-22)，5.02(1H，dd，J= 15.2，8.6 Hz，H-23)，3.53(1H，m，H-3)，1.01(3H，s，H-19)，0.92(3H，d，J= 6.5 Hz，H-21)，0.85(3H，d，J= 3.5 Hz，H-27)，0.83(3H，d，J= 1.7 Hz，H-26)，0.81(3H，d，J= 4.5 Hz，H-29)，0.68(3H，s，H-18)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.39(C-1)，29.29(C-2)，71.96(C-3)，42.46(C-4)，140.89(C-5)，121.87(C-6)，32.04(C-7)，32.04(C-8)，50.27(C-9)，36.65(C-10)，21.23(C-11)，39.82(C-12)，42.42(C-13)，56.91(C-14)，24.45(C-15)，29.07(C-16)，56.19(C-17)，12.00(C-18)，19.54(C-19)，40.64(C-20)，21.23(C-21)，138.46(C-22)，129.41(C-23)，51.38(C-24)，31.78(C-25)，21.36(C-26)，19.17(C-27)，25.55(C-28)，12.12(C-29)。以上数据与文献(贾瑞芳等，2021)一致，故鉴定化合物7为豆甾醇。

化合物8无色油状物，C52H88O7，ESI-MSm/z：847.6 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CDCl3)δ：5.35(1H，d，J= 3.3 Hz，H-6)，5.23(1H，dd，J= 15.2，7.8 Hz，H-22)，5.17(1H，dd，J= 15.2，7.1 Hz，H-23)，4.70(2H，m，H-27)，4.37(1H，d，J= 7.6 Hz，H-1′)，1.99(3H，s，H-26)，1.02(3H，s，H-19)，1.01(3H，d，J= 6.6 Hz，H-21)，0.99(3H，s，H-18)，0.81(3H，s，H-29)，0.69(3H，s，H-17″)；13C-NMR(100 MHz，CDCl3)δ：37.30(C-1)，31.95(C-2)，79.72(C-3)，39.70(C-4)，140.36(C-5)，122.06(C-6)，34.29(C-7)，31.88(C-8)，50.19(C-9)，36.72(C-10)，21.08(C-11)，38.93(C-12)，42.27(C-13)，56.87(C-14)，25.00(C-15)，28.72(C-16)，55.92(C-17)，12.06(C-18)，19.38(C-19)，40.23(C-20)，20.85(C-21)，137.16(C-22)，130.12(C-23)，52.01(C-24)，148.55(C-25)，20.22(C-26)，109.55(C-27)，25.71(C-28)，12.14(C-29)；101.26(C-1′)，76.18(C-2′)，73.77(C-3′)，73.42(C-4′)，70.38(C-5′)，63.57(C-6′)；174.33(C-1″)，34.29(C-2″)，31.88(C-3″)，29.70(C-4″-C-14″)，24.33(C-15″)，22.71(C-16″)，14.13(C-17″)。以上数据与文献(Xu et al.，2013)一致，故鉴定化合物8为22-dehydroclerosterol-3-O-β-D-(6′-O-margaroyl)-glucopyranoside。

化合物9白色无定形粉末，C35H56O6，ESI-MSm/z：595.4 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ：5.33(1H，s，H-6)，5.22(1H，dd，J= 12.6，4.8 Hz，H-22)，5.19(1H，dd，J= 12.2，5.1 Hz，H-23)，4.68(2H，s，H-27)，4.22(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1′)，1.61(3H，s，H-26)，0.98(3H，d，J= 6.7 Hz，H-21)，0.96(3H，s，H-19)，0.79(3H，t，J= 7.3 Hz，H-29)，0.67(3H，s，H-18)；13C-NMR(100 MHz，DMSO)δ：36.85(C-1)，31.43(C-2)，76.95(C-3)，38.34(C-4)，140.48(C-5)，121.21(C-6)，29.29(C-7)，31.43(C-8)，49.65(C-9)，36.25(C-10)，21.49(C-11)，38.34(C-12)，41.80(C-13)，56.26(C-14)，23.88(C-15)，28.31(C-16)，55.30(C-17)，11.88(C-18)，19.12(C-19)，40.44(C-20)，19.94(C-21)，136.84(C-22)，129.59(C-23)，51.31(C-24)，147.70(C-25)，20.71(C-26)，109.98(C-27)，25.23(C-28)，12.02(C-29)；100.81(C-1′)，73.49(C-2′)，76.78(C-3′)，70.11(C-4′)，76.95(C-5′)，61.11(C-6′)。以上数据与文献(Saeedan et al.，1997)一致，故鉴定化合物9为3-O-β-D-galactopyranosyl-(24β)-ethylcholesta-5,22,25-trien。

化合物10淡黄色粉末，C31H40O15，ESI-MSm/z：675.3 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ：7.56(1H，d，J= 15.8 Hz，H-7′)，7.29(1H，d，J= 1.7 Hz，H-2′)，6.82(1H，d，J= 8.0 Hz，H-5′)，6.40(1H，d，J= 15.8 Hz，H-8′)，5.06(1H，s，H-1‴)，4.38(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1″)，3.82(3H，s，3-OCH3)，3.79(3H，s，3′-OCH3)，2.76(2H，m，H-7)，1.12(3H，d，J= 6.1 Hz，H-6‴)；13C-NMR(100 MHz，DMSO)δ：132.80(C-1)，112.70(C-2)，147.90(C-3)，147.42(C-4)，117.34(C-5)，121.25(C-6)，36.68(C-7)，72.22(C-8)，56.41(3-OCH3)；127.05(C-1′)，117.96(C-2′)，151.54(C-3′)，149.77(C-4′)，115.56(C-5′)，124.99(C-6′)，147.80(C-7′)，113.98(C-8′)，167.65(C-9′)，57.33(3′-OCH3)；104.03(C-1″)，76.21(C-2″)，80.95(C-3″)，70.51(C-4″)，76.24(C-5″)，62.43(C-6″)；102.97(C-1‴)，72.07(C-2‴)，71.87(C-3‴)，73.37(C-4‴)，70.83(C-5‴)，19.79(C-6‴)。以上数据与文献(高映等，2017)一致，故鉴定化合物10为肉苁蓉苷D。

化合物11淡黄色粉末，C26H30O11，ESI-MSm/z：541.2 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.57(1H，d，J= 7.9 Hz，H-9′)，7.61(1H，d，J= 15.7 Hz，H-7′)，7.00(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，6.86(1H，dd，J= 8.2，1.9 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5)，6.74(1H，dd，J= 8.0，16.0 Hz，H-8′)，4.37(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1″)，3.91(3H，s，3-OCH3)，3.83(3H，s，3′-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.52(C-1)，110.82(C-2)，149.12(C-3)，147.83(C-4)，116.17(C-5)，119.96(C-6)，90.18(C-7)，52.17(C-8)，71.95(C-9)，56.44(3-OCH3)；129.67(C-1′)，114.39(C-2′)，145.92(C-3′)，152.75(C-4′)，131.33(C-5′)，120.29(C-6′)，156.26(C-7′)，127.14(C-8′)，196.28(C-9′)，56.76(3′-OCH3)；104.34(C-1″)，75.14(C-2″)，78.03(C-3″)，71.56(C-4″)，78.17(C-5″)，62.69(C-6″)。以上数据与文献(孟永海，2007)一致，故鉴定化合物11为 tortoside F。

化合物12淡黄色粉末，C20H20O6，ESI-MSm/z：379.1 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：9.58(1H，d，J= 7.8 Hz，H-9′)，7.62(1H，d，J= 15.8Hz，H-7′)，7.29(1H，s，H-6′)，7.23(1H，d，J= 1.3 Hz，H-2′)，6.95(1H，d，J= 1.8 Hz，H-2)，6.83(1H，dd，J= 8.2，1.8 Hz，H-6)，6.78(1H，d，J= 8.1 Hz，H-5)，6.69(1H，dd，J= 15.7，7.8 Hz，H-8′)，5.61(1H，d，J= 6.4 Hz，H-7)，3.91(3H，s，3′-OCH3)，3.82(3H，s，3-OCH3)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：133.91(C-1)，110.55(C-2)，149.19(C-3)，147.83(C-4)，131.25(C-5)，119.99(C-6)，90.10(C-7)，54.65(C-8)，64.54(C-9)，56.78(3-OCH3)；129.62(C-1′)，114.21(C-2′)，146.02(C-3′)，152.94(C-4′)，130.85(C-5′)，119.80(C-6′)，156.16(C-7′)，127.09(C-8′)，196.19(C-9′)，56.37(3′-OCH3)。以上数据与文献(Li et al.，2017)一致，故鉴定化合物12为balanophonin。

化合物13黄色粉末，C21H20O11，ESI-MSm/z：471.1 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ：12.99(1H，s，5-OH)，7.44(1H，d，J=8.3，2.2Hz，H-6′)，7.42(1H，d，J= 2.1 Hz，H-2′)，6.90(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5′)，6.78(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.75(1H，s，H-3)，6.44(1H，d，J= 2.1 Hz，H-6)，5.08(1H，d，J= 7.4 Hz，H-1″)；13C-NMR(100 MHz，DMSO)δ：164.50(C-2)，103.20(C-3)，181.94(C-4)，161.16(C-5)，99.56(C-6)，162.97(C-7)，94.74(C-8)，156.98(C-9)，105.37(C-10)；121.39(C-1′)，113.60(C-2′)，145.82(C-3′)，149.98(C-4′)，116.02(C-5′)，119.21(C-6′)；99.88(C-1″)，73.15(C-2″)，77.19(C-3″)，69.56(C-4″)，76.42(C-5″)，60.63(C-6″)。以上数据与文献(周志强，2013)一致，故鉴定化合物13为木犀草苷。

化合物14黄色粉末，C29H36O15，ESI-MSm/z：647.2 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.56(1H，d，J= 12.8 Hz，H-7′)，7.03(1H，d，J= 1.4 Hz，H-2′)，6.92(1H，dd，J= 8.0，1.4 Hz，H-6′)，6.75(1H，d，J= 6.6 Hz，H-5′)，6.67(1H，d，J= 1.4 Hz，H-2)，6.65(1H，d，J= 6.4 Hz，H-5)，6.52(1H，dd，J= 1.4，7.8 Hz，H-6)，6. 25(1H，d，J= 12.7 Hz，H-8′)，5.16(1H，s，H-1‴)，4.34(1H，d，J= 6.3 Hz，H-1″)，1.06(3H，d，J= 4.9 Hz，H-6‴)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：131.39(C-1)，117.07(C-2)，145.94(C-3)，144.49(C-4)，114.55(C-5)，121.26(C-6)，36.41(C-7)，70.33(C-8)；127.53(C-1′)，116.28(C-2′)，146.66(C-3′)，149.65(C-4′)，116.48(C-5′)，123.25(C-6′)，148.01(C-7′)，115.17(C-8′)，168.31(C-9′)；104.00(C-1″)，76.04(C-2″)，81.65(C-3″)，71.91(C-4″)，75.78(C-5″)，62.19(C-6″)；102.94(C-1‴)，72.18(C-2‴)，72.21(C-3‴)，73.66(C-4‴)，70.42(C-5‴)，18.40(C-6‴)。以上数据与文献(高燕萍等，2016)一致，故鉴定化合物14为类叶升麻苷。

化合物15黄色粉末，C15H10O6，ESI-MSm/z：309.0 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：12.96(1H，s，5-OH)，10.81(1H，s，7-OH)，9.91(1H，s，3′-OH)，9.39(1H，s，4′-OH)，7.40(1H，dd，J= 8.3，2.3 Hz，H-6′)，7.38(1H，d，J= 2.2 Hz，H-2′)，6.88(1H，d，J= 8.3 Hz，H-5′)，6.66(1H，s，H-3)，6.43(1H，d，J= 2.1 Hz，H-8)，6.18(1H，d，J= 2.0 Hz，H-6)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：164.76(C-2)，102.48(C-3)，182.49(C-4)，161.85(C-5)，98.78(C-6)，164.97(C-7)，93.65(C-8)，158.05(C-9)，103.91(C-10)；122.32(C-1′)，112.78(C-2′)，145.68(C-3′)，149.64(C-4′)，115.41(C-5′)，118.92(C-6′)。以上数据与文献(李勇军等，2005)一致，故鉴定化合物15为木犀草素。

化合物16白色结晶，C17H24O8，ESI-MSm/z：379.1 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，DMSO)δ：6.68(2H，s，H-3，5)，6.33(1H，d，J= 16.3 Hz，H-7)，6.24(1H，m，H-8)，4.89(1H，d，J= 7.3 Hz，H-1′)，3.76(6H，s，2-OCH3，6-OCH3)，1.83(3H，d，J= 5.8 Hz，H-9)；13C-NMR(100 MHz，DMSO)δ：134.07(C-1)，153.16(C-2，6)，104.54(C-3，5)，133.62(C-4)，131.21(C-7)，125.34(C-8)，18.61(C-9)，56.81(2-OCH3，6-OCH3)；103.09(C-1′)，74.64(C-2′)，77.66(C-3′)，70.40(C-4′)，77.00(C-5′)，61.37(C-6′)。以上数据与文献(刘燕等，2015)一致，故鉴定化合物16为 acantrifoside E。

化合物17白色胶状，C32H50O13，ESI-MSm/z：665.3 [M+Na]+。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：6.47(1H，s，H-14)，4.44(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1′)，4.33(1H，d，J= 7.8 Hz，H-1″)，3.22(1H，d，J= 7.9 Hz，H-3)，1.20(3H，s，H-20)，1.19(3H，d，J= 6.8 Hz，H-17)，1.17(3H，d，J= 6.9 Hz，H-16)，1.01(3H，s，H-18)，0.86(3H，s，H-19)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：34.59(C-1)，26.53(C-2)，88.10(C-3)，39.41(C-4)，52.72(C-5)，18.87(C-6)，33.12(C-7)，133.52(C-8)，132.28(C-9)，38.87(C-10)，147.54(C-11)，141.10(C-12)，139.48(C-13)，116.46(C-14)，25.24(C-15)，22.51(C-16)，22.80(C-17)，27.84(C-18)，16.92(C-19)，19.55(C-20)；106.62(C-1′)，73.83(C-2′)，76.86(C-3′)，70.31(C-4′)，76.74(C-5′)，61.44(C-6′)；103.96(C-1″)，74.08(C-2″)，79.07(C-3″)，69.66(C-4″)，76.65(C-5″)，60.90(C-6″)。以上数据与文献(Hu et al.，2018)一致，故鉴定化合物17为 trichotomside B。

化合物18淡黄色粉末，C30H38O15，ESI-MSm/z：637 [M-H]-。1H-NMR(400 MHz，CD3OD)δ：7.59(1H，d，J= 15.8 Hz，H-7′)，7.07(1H，s，H-2′)，6.95(1H，d，J= 8.3 Hz，H-6′)，6.80(1H，d，J= 3.2 Hz，H-5′)，6.78(1H，d，J =3.2 Hz，H-2)，6.73(1H，d，J= 1.8 Hz，H-5)，6.66(1H，d，J= 1.8 Hz，H-6)，6.28(1H，d，J= 15.9 Hz，H-8′)，5.19(1H，s，H-1‴)，4.37(1H，d，J= 7.9 Hz，H-1″)，3.80(3H，s，3-OCH3)，2.80(2H，t，J= 6.8 Hz，H-7)，1.09(3H，d，J= 6.2 Hz，H-6‴)；13C-NMR(100 MHz，CD3OD)δ：132.71(C-1)，116.97(C-2)，147.12(C-3)，146.66(C-4)，112.69(C-5)，121.14(C-6)，36.40(C-7)，72.22(C-8)，56.40(3-OCH3)；127.53(C-1′)，115.18(C-2′)，147.37(C-3′)，149.63(C-4′)，116.48(C-5′)，123.23(C-6′)，147.97(C-7′)，114.57(C-8′)，168.27(C-9′)；104.02(C-1″)，76.03(C-2″)，81.63(C-3″)，71.93(C-4″)，75.80(C-5″)，62.22(C-6″)，102.93(C-1‴)，70.43(C-2‴)，72.02(C-3‴)，73.67(C-4‴)，70.32(C-5‴)，18.42(C-6‴)。以上数据与文献(李友宾等，2005)一致，故鉴定化合物18为肉苁蓉苷 C。

2.2 抗菌活性结果

采用MTT法测试大青粗提物对乳房链球菌、无乳链球菌的抗菌活性。结果显示，正丁醇部位Fr.B3、Fr.C1、Fr.D2组分对乳房链球菌有抗菌活性， IC50分别为7.02、0.89、6.79 mg·mL-1； Fr.B3、Fr.C1、Fr.C3、Fr.C4、Fr.D2 5份粗提物对无乳链球菌有抗菌活性，IC50分别为2.38、0.72、1.31、4.63、0.98 mg·mL-1。这表明Fr.C1部位具有一定的抗菌活性。

图 1 化合物1-18结构式Fig. 1 Structures of compounds 1-18

采用同样的方法对经过粗筛活性较好的部位Fr.C1分离得到的2个单体化合物进行抗菌活性测试，测定结果为化合物13对乳房链球菌有一定的抑制活性，MIC为0.18 mg·mL-1，对无乳链球菌无明显抑制活性；化合物14对乳房链球菌和无乳链球菌均无明显抑制活性。

3 讨论与结论

本研究对黔产大青乙醇提取物中化学成分进行分离鉴定，从中共得到了18个化合物。经查阅相关文献，化合物2、3、5、6、8-13、16-18均为首次从大青中分离得到。部分化合物的抗菌活性试验结果表明，化合物13对乳房链球菌有一定的抑制活性。

木犀草苷(13)是木犀草素(15)7-OH配糖化后的一种苷，研究表明木犀草素(15)能通过破坏细菌细胞壁和细胞膜结构完整性和抑制DNA拓扑异构酶活性发挥抗菌效果(王倩和谢明杰，2010)，木犀草苷(13)对乳房链球菌的抑制作用是否也通过上述机制得以实现，还有待进一步深入研究。本次实验中虽然类叶升麻苷(14)未表现出抗菌活性，但该化合物具有较强抗氧化活性(杨建华等，2009)，可以对抗因炎症反应而产生的过氧化物，进而修复炎症组织。奶牛乳房炎是由多种因素引起的炎症反应，主要是病原微生物的感染，常见致病菌有无乳链球菌、乳房链球菌、金黄色葡萄球菌等(张晓东等，2021)。此外，奶牛乳房组织新陈代谢旺盛，体内自由基含量过高引起氧化应激，亦可损伤奶牛乳房细胞进而诱发乳房炎(郭咏梅和闫素梅，2021)。如果将具有抗奶牛乳房炎致病菌作用的木犀草苷(13)与对抗炎症反应的类叶升麻苷(14)联用，是否能显著增强对奶牛乳房炎的防治效果，还需进一步探究。本研究丰富了大青化学成分的物质基础，初步探讨了其抗菌活性成分，为后续大青抗奶牛乳房炎药物的研发提供了一定参考，拓展了苗族医药在动物疾病防治方面的应用。