饲料中添加牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响

黄 河 庄 镱 钟国防, 唐香山

(1. 上海海洋大学水产科学国家级实验教学示范中心, 上海 201306; 2. 上海海洋大学农业部鱼类营养与环境生态研究中心, 上海 201306; 3. 上海海洋大学农业部淡水水产种质资源重点实验室, 上海 201306; 4. 杭州眺旺生物科技有限公司, 杭州 310030)

大口黑鲈(Micropterus salmoides), 俗称加州鲈,自20世纪80年代引入我国, 经过多年养殖发展, 目前已经成为我国淡水养殖的重要品种之一。据统计, 2019年年产量高达477808000 kg, 同比增长10.59%[1]。但是随着集约化养殖的快速发展及饲养方式不规范, 加州鲈病害频发。预防和治疗鱼类细菌性疾病的传统方法是在水产饲料中添加抗生素。然而滥用抗生素会导致细菌耐药性、免疫抑制和药物残留等问题[2]。因此抗生素的安全使用一直倍受关注, 欧盟自2006年起便禁止在动物饲料中添加抗生素。2019年我国农业农村部宣布自2020年7月1日起, 饲料企业全面禁抗[3]。于是筛选合适的抗生素替代品用于水产养殖产业是当务之急, 对日益发展壮大的大口黑鲈等水产动物养殖业具有深远的意义。

对抗生素替代品的研究发现, 抗菌肽是生物体内非特异性免疫系统产生的一种多肽类物质, 因其独特的生物活性、异于传统抗生素的抑菌和杀菌机制、不易产生耐药性和无污染等优点, 有望被开发成为一类新型高效抗菌药物, 在饲料添加剂领域具备替代抗生素的巨大潜力[4]。有研究表明, 在饲料中添加不超过20 mg/kg的重组抗菌肽能显著提高罗非鱼(Oreochromis niloticus)幼鱼生长性能和部分免疫指标以及攻毒后存活率, 而50 mg/kg抗菌肽在一定程度上对罗非鱼幼鱼的生长性能和部分酶指标则有抑制作用[5]。同样, 在湘云鲫(Carassius auratusXiangyun)[6]的研究中也发现, 在饲料中添加150 mg/kg天蚕素抗菌肽可以显著提高湘云鲫的生长性能、血清非特异性免疫力和抗病力。另外,翟少伟等[7]研究认为, 在饲料中适量添加抗菌肽Surfactin可增加吉富罗非鱼肠道皱襞高度、调节肠道菌群和提高肠道抗氧化能力。

本试验所用的牛乳铁蛋白肽(Bovine lactoferricin, LfcinB)是一种由牛乳铁蛋白在酸性条件下经胃蛋白酶水解产生的含25个氨基酸残基的阳离子型抗菌肽, 这些氨基酸残基通过分子内的二硫键形成某种扭曲的反平行 β 折叠结构, 使其生物活性强于牛乳铁蛋白, 具有更强的抗菌和抗病毒能力[8,9]。另外, 牛乳铁蛋白肽溶解时会形成一个正电荷残基包围起来的疏水表面, 使其具有水脂两亲性的特点[10],所以它具有乳化功能, 可以促进营养物质的吸收[11]。因此, 牛乳铁蛋白肽可以成为良好的抗生素替代品。但是, 目前关于它的研究主要集中在对细菌膜超微结构的影响[12]、体外抑菌效果[13,14]和对疾病创面愈合的促进作用[15]等方面, 而作为饲料添加剂的研究目前只在牛乳铁蛋白上有所报道, 所涉及的水产动物包括尼罗罗非鱼[16]、亚洲鲶(Clarias batrachus)[17]、虹鳟(Oncorhynchus mykiss)[18,19]、黄鳍鲷(Acanthopagrus latus)[20]等, 牛乳铁蛋白肽上还未见报道。本文通过在研究饲料中添加牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能、消化酶活力、肠道组织结构及抗病力的影响, 旨在评估其替代抗生素的潜力, 为牛乳铁蛋白肽在渔用功能性饲料中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验饲料

在以白鱼粉和发酵豆粕为主要蛋白源, 鱼油、豆油和大豆磷脂油为主要脂肪源的基础饲料中分别添加0 (阴性对照)、1000、1500和2000 mg/kg牛乳铁蛋白肽(由杭州眺旺生物科技有限公司研发并生产)及30 mg/kg氟苯尼考(阳性对照), 并依次命名为LfcinB0、LfcinB1000、LfcinB1500、LfcinB2000和F。将原料粉碎, 称重, 混合均匀, 然后加入油脂和水, 彻底混合。经饲料制粒机制成直径2 mm的颗粒, 60℃烘至水分低于10%, 密封于-20℃冰箱保存备用。试验基础饲料配方及营养水平如表 1。

表1 基础饲料组成及营养水平(%干饲料)Tab. 1 Composition and nutrient levels of the basal diet (% dry diet)

1.2 试验分组与管理

饲养试验场地位于上海海洋大学滨海养殖基地内场, 试验用鱼购自于上海秦皇山渔业有限公司,试验正式开始之前暂养1周, 暂养期间投喂LfcinB0组基础饲料。试验前大口黑鲈饥饿24h, 然后挑选450尾(19.88±0.03) g健康、规格均匀的幼鱼用于养殖试验, 每组3个重复, 随机放置30尾于15个大小一致的网箱(1 m ×1 m × 1 m)中。试验周期为8周, 采取表观饱食方式进行投喂, 每日两次(8: 00和16:00)。定期检测水质, 水温在24—30℃, 氨氮＜0.5 mg/L, pH为7.5—8.5, 溶氧＞5 mg/L, 每3天换水1次, 换水量占网箱水容量1/3左右。

1.3 样品采集与指标测定

饲料营养成分的测定饲料水分含量采用105℃烘箱干燥恒重法(GB/T 6435-2014)测定, 粗蛋白质、粗脂肪含量依次采用凯氏定氮法(GB/T 6432-2018)、索氏抽提法(GB/T 6433-2006)测定。

生长及形体指标的测定经过8周饲养试验后, 将大口黑鲈禁食24h, 然后统计每个网箱中鱼的存活数并称重, 用于计算生长指标。每网箱随机取6尾鱼, 使用MS-222(60 mg/L)麻醉后测体长和体重。解剖, 测量肝脏重和内脏重, 用于肝体比和脏体比的计算。

增重率(Weight gain rate, WGR, %)=100×(试验鱼终末体重-试验鱼初始体重)/试验鱼初始体重

特定生长率(Specific growth rate, SGR, %/d)=100×(ln试验鱼终末体重-ln试验鱼初始体重) /试验天数

成活率(Survival rate, SR, %)=100×试验终末鱼尾数/试验初始鱼尾数

饲料系数(Feed coefficient ratio, FCR)=摄食饲料质量/(试验鱼终末体重-试验鱼初始体重)

肥满度(Condition factor, CF, g/cm3)=100×体重/体长3

肝体比(Hepatosomatic index, HSI)=100×肝脏重/体重

脏体比(Viscerosomatic index, VSI)=100×内脏团重/体重

肠道组织结构指标的测定每网箱随机取3尾鱼的肠, 分前肠、中肠和后肠(各1 cm), 用0.86%生理盐水冲洗后浸入Bouin氏液中。肠组织(每个网箱3个样品)在Bouin氏液中浸泡24h之后转入70%无水乙醇中, 1周内用一系列乙醇溶液脱水,石蜡包埋。切片(6 μm), 苏木精-伊红(HE)染色, 中性树脂封闭。每组前、中和后肠各9个切片, 用成像显微镜(Nikon YS100, 日本)观察组织的形态结构。每个切片测量15个绒毛的高度和宽度。图像分析采用ImageJ14.0图像分析软件。

肠道消化酶活力的测定每网箱随机取3尾鱼的全肠于-20℃保存, 将样品在冰上解冻, 用0.86%的冷生理盐水漂洗, 除去血液, 滤纸擦干, 称重, 按重量 (g)∶体积 (mL) 比=1∶9的比例加入匀浆介质或0.86%冷生理盐水, 冰浴条件下机械匀浆, 离心后取上清液用于肠道消化酶活力的测定。肠胰蛋白酶(Trypsin)、α-淀粉酶(α-amylase)和脂肪酶(Lipase)活力均采用南京建成生物技术研究所的测试试剂盒进行测定, 测定方法参照说明书。肠匀浆上清液的蛋白质浓度采用考马斯亮蓝染色法测定。

攻毒试验试验所用的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)菌种由上海海洋大学病原库提供, 先用营养琼脂培养基在28℃恒温培养箱中培养24h(复壮), 再挑取少量菌落于营养肉汤培养基在28℃摇床培养箱中培24h, 最后将菌液在4000 r/min条件下离心5min, 收集沉淀的细菌, 用灭菌生理盐水稀释至终浓度为1×107CFU/mL, 置4℃冰箱中保存备用。在试验结束后, 分别从各组取30尾试验鱼,每组3个重复, 每个重复10尾鱼, 进行人工感染试验。每尾鱼经胸鳍基部注射200 μL/100 g体重的嗜水气单胞菌菌液进行攻毒, 然后放回养殖网箱。连续7d记录每天试验鱼的死亡数目, 计算存活率和死亡率, 根据死亡率计算免疫保护率, 根据每日存活数量使用Graphpad Prism 8.4.0软件作生存曲线图。

存活率(%)=100×存活数/初始试验鱼总数;

死亡率(%)=100×死亡数/初始试验鱼总数;

免疫保护力(%)=100×(阴性对照组试验鱼死亡率-试验组试验鱼死亡率)/阴性对照组试验鱼死亡率。

1.4 数据处理

使用SPSS 25.0软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA), 用Duncan法进行多重差异显著性检验, 数据以平均值±标准误(mean±SE)表示,P＜0.05表明不同组差异显著。

2 结果

2.1 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能的影响

随着饲料中牛乳铁蛋白肽含量的增加, 大口黑鲈幼鱼的FBW、WGR和SGR均呈现先增加后降低的趋势, LfcinB1000组结果最好且与各组均有显著差异(P＜0.05)。各组间的SR和FCR无显著差异(P＞0.05; 表 2)。

表2 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长指标的影响Tab. 2 Effects of bovine lactoferricin on growth indexes of juvenile largemouth bass

饲料中添加1000 、1500和2000 mg/kg牛乳铁蛋白肽及30 mg/kg氟苯尼考对大口黑鲈幼鱼的形体指标CF、HSI和VSI不会造成显著影响(P＞0.05;表 3)。

表3 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼形体指标的影响Tab. 3 Effects of bovine lactoferricin on body indexes of juvenile largemouth bass

2.2 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼消化酶活力的影响

与阴性对照组相比, LfcinB1000组肠道胰蛋白酶、α-淀粉酶、脂肪酶活力均显著升高(P＜0.05),LfcinB1500、LfcinB2000组肠道胰蛋白酶、α-淀粉酶活力无显著变化(P＞0.05), LfcinB1500组肠道脂肪酶活力显著上升(P＜0.05), LfcinB2000组肠道脂肪酶活力无显著变化(P＞0.05), 阳性对照组的肠道胰蛋白酶活力显著下降(P＜0.05)、α-淀粉酶和脂肪酶活力无显著变化(P＞0.05)。LfcinB1000组肠道消化酶活力显著高于其余各组(P＜0.05; 表 4)。

表4 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道消化酶活力的影响Tab. 4 Effects of bovine lactoferricin on the activity of digestive enzymes in juvenile largemouth bass

2.3 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道组织结构的影响

观察肠道组织结构切片发现: 前肠, LfcinB1000组杯状细胞数目增加, LfcinB1500、LfcinB2000、F组黏膜下层与肌层间出现空隙; 中肠, LfcinB1500、LfcinB2000组黏膜层与固有层间出现空隙; 后肠,LfcinB1500、LfcinB2000组黏膜下层与肌层、黏膜层与固有层间均出现空隙(图 1)。

图1 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道组织结构的影响Fig. 1 Effects of bovine lactoferricin on intestinal tissue structure of juvenile largemouth bass

肠道切片量化数据表明, 随着饲料中牛乳铁蛋白肽添加量的增加, 肠道绒毛高度和宽度均呈现先升后降的趋势, LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000组前肠和中肠绒毛高度均显著高于阴性对照组(P＜0.05), LfcinB1000和LfcinB1500组后肠绒毛高度显著高于阴性对照组(P＜0.05)。LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000组前肠绒毛高度显著高于阳性对照组(P＜0.05), LfcinB1000和LfcinB1500组中肠和后肠绒毛高度显著高于阳性对照组(P＜0.05)。LfcinB1000组前肠和后肠绒毛宽度显著宽于阴阳两对照组(P＜0.05), LfcinB1000、LfcinB1500和LfcinB2000组中肠绒毛宽度和阴性对照组无显著差异(P＞0.05), 但均显著宽于阳性对照组(P＜0.05)。与阴性对照组相比, 阳性对照组肠道绒毛高度和宽度一定程度上均有所降低, 但只有前肠和中肠的宽度变化显著(P＜0.05; 表 5)。

表5 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道组织结构的影响Tab. 5 Effects of bovine lactoferricin on intestinal tissue structure of juvenile largemouth bass

2.4 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼抗病力的影响

与阴性对照组相比, 在饲料中添加牛乳铁蛋白肽及氟苯尼考均能提高嗜水气单胞菌攻毒的大口黑鲈幼鱼的存活率(表 6)。LfcinB1000组与F组大口黑鲈3—7d的存活率和免疫保护率基本相同, 这说明适量牛乳铁蛋白肽与氟苯尼考的免疫保护效果相当。同时, LfcinB1000组的存活率与阴性对照组的存活率存在极显著差异(P＜0.01), 阳性对照组的存活率显著高于阴性对照组(P＜0.05), 其余各组间差异并不显著(P＞0.05; 图 2)。

图2 生存曲线Fig. 2 Survival curve

表6 牛乳铁蛋白肽对攻毒后大口黑鲈幼鱼存活率和免疫保护率的影响Tab. 6 Effect of bovine lactoferricin on survival rate and immune protection rate of juvenile largemouth bass after challenge

3 讨论

3.1 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼生长性能的影响

本研究结果表明, 在饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽能显著提高大口黑鲈幼鱼的FBW、WGR和SGR, 但添加量过高反而会抑制其生长。这与其他水产动物在饲料中添加抗菌肽的研究结果相似。如陈冰等[21]在凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的饲料中添加2000 mg/kg家蝇抗菌肽, 显著提高了对虾的SR、WGR和SGR, 但随着剂量的增加, 这些指标逐渐降低。同样, 在姜珊等[5]对吉富罗非鱼的研究中, 当饲料中添加5 mg/kg重组抗菌肽,鱼体的FBW、WGR和SGR均明显增加, 但当抗菌肽剂量增至50 mg/kg时, 鱼体的生长却受到抑制。在黄鳍鲷的研究中也已经观察到添加400—1200 mg/kg牛乳铁蛋白的饲料显著促进了鱼体生长[20]。此外, 本试验结果还显示, 在饲料中添加牛乳铁蛋白肽不会显著影响大口黑鲈幼鱼的CF、HSI和VSI。这和王自蕊等[6]研究饲料中添加天蚕素抗菌肽对湘云鲫的影响得到的添加量为150 mg/kg时, 湘云鲫的肾脏指数、肝胰脏指数、内脏指数和脾脏指数没有显著变化的结论相似。另外也有研究发现, 饲料中添加100—1600 mg/kg的牛乳铁蛋白对西伯利亚鲟(Acipenser baeri)的CF和HSI无显著影响[22]。抗菌肽的适宜添加量的不同可能与动物品种以及抗菌肽的种类有关, 而抗菌肽促生长的机制还有待进一步研究。

3.2 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼消化酶活力的影响

鱼类对饲料营养成分消化、吸收和利用的能力通常由营养物质消化率或消化酶活性衡量[23]。目前关于抗菌肽对动物消化作用影响的研究主要集中在畜禽方面, Yoon等[24]的研究结果显示, 合成抗菌肽A3和P5添加组断奶仔猪全肠的营养物质表观消化率均显著高于对照组。在对肉鸡的研究中,也有在饲料中添加抗菌脂肽(4000 U/kg)提高十二指肠和空肠内容物脂肪酶和蛋白酶活力的报道[25]。然而, 在饲料中添加0.5 g/kg的蚕抗菌肽AD-酵母制剂对粤黄鸡肠道内容物的淀粉酶和蛋白酶活力并无显著影响[26]。这种结果的差异可能是由于所用抗菌肽的种类和来源(天然或者合成)及物种不同所致。本试验结果表明, 在饲料中添加1000 mg/kg的牛乳铁蛋白肽可以显著提高大口黑鲈幼鱼肠道胰蛋白酶、α-淀粉酶和脂肪酶的活力, 因此该剂量牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道消化能力的提高具有显著的促进作用。除牛乳铁蛋白肽溶解时疏水表面的水脂两亲性特点有助于营养物质消化外[10,11],抗菌肽提高鱼类消化酶活性的机制还可能与其对消化道的生长发育的促进作用有关, 研究表明, 抗菌肽能促进动物肠道的发育, 增加肠绒毛高度, 而绒毛高度与肠道成熟吸收细胞数量成正相关, 肠道成熟吸收细胞数量又与肠道消化酶活性成正相关[27,28]。

3.3 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼肠道组织结构的影响

肠道是鱼类营养物质吸收的主要部位, 而营养物质通过存在于刷状边缘和基底外侧膜的特定转运体进出肠细胞[29], 肠道绒毛高度的增加通常与更好的肠道健康、更高的营养吸收效率密切相关, 从而导致生长性能的改善[30]。在本研究中, 饲料中添加牛乳铁蛋白肽在一定程度上提高了鱼类前、中、后肠绒毛高度和宽度, 1000 mg/kg添加组结果最好且显著优于阴阳两对照组, 说明添加一定水平的牛乳铁蛋白肽对肠绒毛的生长发育具有明显促进作用。研究表明, 抗菌肽能通过促进肠道上皮细胞的增殖和胞外基质蛋白生成的方式修复肠道损伤[31,32], 同时还可以促进有益菌生长、抑制有害菌生长, 优化肠道菌群结构, 从而间接促进肠道发育[31—33]。因此在本研究中, 可能是由于饲料中牛乳铁蛋白肽的添加使得肠道组织结构得以改善, 从而提高了大口黑鲈幼鱼的生长性能。该结果和已有的研究结果类似, Yoon等[24]发现饲料中添加合成抗菌肽A3和P5可增加断奶仔猪十二指肠和空肠的绒毛高度,提高平均日增重。史庆超等[34]认为饲料中添加抗菌肽Surfactin可以显著提高吉富罗非鱼肠绒毛高度, 促进其生长。

杯状细胞分布于黏膜柱状上皮细胞之间, 可以分泌黏液协助消化和保护胃肠道组织免受损伤[35]。肠道组织的完整是保证营养物质的顺利吸收和防止各类有害病菌异物进入动物机体内部的保障[36]。本试验结果表明, 在饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽时, 大口黑鲈幼鱼前肠杯状细胞数目增加,而随着牛乳铁蛋白肽添加量的持续增加, 肠道组织的完整性有所下降。这说明牛乳铁蛋白肽对肠道发育的促进作用受到其添加量的影响, 适量添加有益于肠道发育、过高反而会减弱其效果。同样, 翟少伟等[7]在吉富罗非鱼的研究中发现, 在饲料中添加50 mg/kg抗菌肽Surfactin对肠道健康状态的改善作用显著优于其他高剂量添加组。

3.4 牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼抗病力的影响

鱼类的抗病力及免疫力一般可以通过其感染致病菌后的死亡率高低来判断[37], 本文以存活率及免疫保护率来评价鱼类的免疫机制。已有大量研究证实, 抗菌肽能够为水生动物提供免疫保护作用[5,6,38]。姜珊等[5]发现, 饲料中添加5—20 mg/kg重组抗菌肽可以显著降低嗜水气单胞菌攻毒后吉富罗非鱼的死亡率, 5 mg/kg组存活率最高。同样, 日粮中补充天蚕素抗菌肽的湘云鲫[6]、锦鲤(Cyprinus carpio koi)[38]分别在抵抗嗜水气单胞菌、维氏气单胞菌感染时都具有存活率提高的良好表现。此外, 饲喂补充牛乳铁蛋白的饲料对尼罗罗非鱼[16]、亚洲鲶[17]、黄鳍鲷[20]的细菌抵抗力也有积极影响。本试验对饲喂牛乳铁蛋白肽后的大口黑鲈采用嗜水气单胞菌进行攻毒, 牛乳铁蛋白肽组的成活率均高于阴性对照组, 1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽组和阳性对照组的存活率明显高于阴性对照组。这表明在饲料中添加适量牛乳铁蛋白肽可以起到和氟苯尼考相当的大口黑鲈抵抗嗜水气单胞菌人工感染的能力, 因而降低了鱼体的死亡率。牛乳铁蛋白肽使大口黑鲈对嗜水气单胞菌抵抗力提高可能和其本身的抗菌作用和免疫调节功能有关。Bellamy等[9]研究发现牛乳铁蛋白肽对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌都有不同程度的抑制作用, 例如产气荚膜梭菌、链球菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌等。嗜水气单胞菌属于革兰氏阴性菌, 推测牛乳铁蛋白肽对其同样具有抵抗能力。其抗菌机理包括: 阻断细菌对铁源的吸收而抑制其生长[39];扰乱代谢途径使细胞膜去极化[40], 影响细胞的细胞器和遗传物质[41]。此外, 彭丽媛[42]认为牛乳铁蛋白肽作为一种阳离子型的抗菌肽, 可以和带负电荷的抗原物质结合, 阻断其对机体的免疫刺激, 它还能通过静电结合内毒素使其丧失毒性。

3.5 氟苯尼考与牛乳铁蛋白肽对大口黑鲈幼鱼作用效果的总体比较

氟苯尼考作为一种广谱抗菌氯霉素类药物, 凭借着生物利用率高、组织渗透性强、半衰期长等特点, 逐渐在水产养殖中被广泛应用[43]。有研究表明, 长期服用抗生素会使鱼类处于应激状态, 导致其肠道微生态紊乱、肠道组织受损并进一步引起饲料利用效率变低、生长性能下降[44]。本试验结果显示, 氟苯尼考的长期使用对大口黑鲈幼鱼的生长、消化酶活力和肠道组织结构均造成了负面影响, 但在抵抗嗜水气单胞菌感染方面作用显著。而在饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽不仅有与氟苯尼考相当的免疫增强效果, 且还可以改善大口黑鲈幼鱼肠道组织结构、提高肠道消化酶活力进而促进其生长。

4 结论

在本试验条件下, 饲料中添加适量牛乳铁蛋白肽能提高大口黑鲈幼鱼的生长性能和消化酶活力、改善肠道组织结构和增强抗病力, 且1000 mg/kg添加组效果最佳, 在抗病力及免疫能力方面与氟苯尼考有相当的作用, 对鱼体肠道组织结构无不良影响。因此, 在大口黑鲈幼鱼饲料中添加1000 mg/kg牛乳铁蛋白肽可作为功能性饲料开发的一个优选方案。